[发明专利]甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第1轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测；其特征在于：

（1）引物设计：扩增甘蔗赤条病菌（Acidovorax avenae subsp. avenae）的引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSD-F1和SRSD-R1的序列如下：

  SRSD-16S-F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

  SRSD-R2：5’-TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT-3’；

SRSD-F1：5’-ACGGTAACAGGTCTTCGGA-3’

SRSD-R1：5’-CAGTTGACATCGTTTAGGGC-3’；

    （2）第1轮PCR扩增：PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，500 ng甘蔗叶片基因组DNA，ddH₂O补足到50 μL； PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、55~60 ℃退火30 S、72 ℃延伸60 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，15 mmol/L MgCl₂；

    （3）第2轮PCR扩增： PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10μmol/L引物SRSD-F1和SRSD-R1各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，第一轮PCR产物稀释100倍后取1.0 μL，ddH₂O补足到50 μL；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、53~57 ℃退火30 S、72 ℃延伸45 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；

    （4）电泳检测：出现一条分子量为755 bp的核酸带的样品，为感染甘蔗赤条病菌的植株叶片样品。