[发明专利]一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，具体的是一种产异丁醇的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

异丁醇是一种典型的长链醇，相对于燃料乙醇而言具有高能量密度、低腐蚀性、低吸湿性、更易与汽油和柴油混合以及与现今的设备更好的相容性等特点。因此，异丁醇成为潜在的新型可再生能源替代品和燃料添加剂。异丁醇除了作为一种潜在的新型汽油代替燃料外，目前在化工市场上也有很多用途。生物质作为一种来源丰富的绿色可再生资源，可以广泛用做发酵制备多种化学品的原料，因此通过可再生资源代谢生成异丁醇有着具有良好的发展前景。

过去的研究表明没有原核生物能够由葡萄糖合成异丁醇，现在研究人员通过一定的基因工程技术对一些宿主菌进行改造从而获得合成异丁醇的能力。目前，以大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌为宿主产异丁醇的研究已有很大的突破。其中，Antonino Baez等在2011年应用1L发酵罐，采用边发酵边分离提取的技术应用大肠杆菌基因工程菌株产异丁醇的量已达到50g/L。

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ATCC 10988是一种革兰氏阴性菌，它独有的ED代谢途径能够高效地利用葡萄糖和果糖生成乙醇。运动发酵单胞菌与其他菌相比能耐受较高浓度的葡萄糖及乙醇，在乙醇浓度5.5%条件下可以不影响生长，浓度达到7.7%时无法生长；在含有20%浓度葡萄糖环境中可以正常生长，当浓度达到40%时仍有11～89%的菌株可以存在。此外，在代谢方面，运动发酵单胞菌具有很高的转化效率，它只把很少量的一部分葡萄糖同化作为构造细胞用，约98%的葡萄糖发酵生成乙醇，只有2%作为碳源。然而，目前还没有利用基因工程的方法研究运动发酵单胞菌产异丁醇的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。

本发明的另一个目的在于提供该基因工程菌的构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：宿主菌为运动发酵单胞菌，转入含氯霉素抗性的重组质粒pZY507KA中。也就是将kivd和adhA连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA,再转入运动发酵单胞菌中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

本发明克隆得到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） 1.2829中的2-酮异戊酸脱羧酶基因（kivd）和醇脱氢酶基因（adhA），并将其连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA。将重组质粒电转化入Z. mobilis中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

本发明所述重组质粒pZY507KA中kivd为2-酮异戊酸脱羧酶基因，来源于乳酸乳球菌中，大小为1434bp，其序列为SEQ ID NO：1。

所述重组质粒pZY507KA中adhA为醇脱氢酶基因，来源于乳酸乳球菌中，大小为1067bp，其序列为SEQ ID NO：2。

所述重组质粒pZY507KA包含表达所需的启动子，启动子下游有一段多克隆位点，多克隆位点包含若干单一酶切位点。

本发明进一步公开了产异丁醇的基因工程菌的构建方法包含如下步骤：

（1）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，利用PCR得到2-酮异戊酸脱羧酶基因。

（2）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，利用PCR得到醇脱氢酶基因。

（3）表达载体的构建：

1）将步骤（1）所得的kivd基因经SacI和BamHI双酶切后与用相同内切酶酶切后的表达载体pZY507连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507K。

2）将步骤（2）所得的adhA基因经BamHI和SalI双酶切后与用相同内切酶酶切后的重组质粒pZY507K连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507KA。

（4）转化：重组质粒pZY507KA转化表达宿主运动发酵单胞菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。