[发明专利]一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1. 一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：宿主菌为运动发酵单胞菌，转入了含氯霉素抗性的重组质粒pZY507KA。

2.权利要求1所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：它是将kivd和adhA连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA,再转入运动发酵单胞菌中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

3.权利要求1或2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA包含表达所需的启动子，启动子下游有一段多克隆位点，多克隆位点包含若干单一酶切位点。

4.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的kivd为2-酮异戊酸脱羧酶基因，大小为1434bp，其序列为SEQ ID NO：1。

5.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的kivd来源为乳酸乳球菌。

6.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的adhA为醇脱氢酶基因，大小为1067bp，其序列为SEQ ID NO：2。

7.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：所述重组质粒pZY507KA中的adhA来源为乳酸乳球菌。

8.一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌的构建方法，其具体步骤如下：

（1）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因（NCBI GeneID: 1114953）为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，利用PCR得到2-酮异戊酸脱羧酶基因；

（2）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因（NCBI GeneID: 1115472）为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，利用PCR得到醇脱氢酶基因；

（3）表达载体的构建：

1）将步骤（1）所得的kivd基因经SacI和BamHI双酶切后与用相同内切酶酶切后的表达载体pZY507连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507K；

2）将步骤（2）所得的adhA基因经BamHI和SalI双酶切后与用相同内切酶酶切后的重组质粒pZY507K连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507KA； 

（4）转化：重组质粒pZY507KA电转化入表达宿主运动发酵单胞菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。