[发明专利]一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。

背景技术

单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的土壤细菌，它也是某些食物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起败血症、脑膜炎和单核细胞增多。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。急需特异性和敏感度高的快速诊断试剂。

环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对单核增生李斯特菌特异性基因序列的一对外引物（L-F3和L-B3）和一对内引物（L-FIP和L-BIP）进行环介导等温扩增。

发明内容

本发明公开了一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X,MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                            400μM

内引物

  L-FIP                                  40umol

  L-BIP                                  40umol

外引物

      L-F3                                    5umol

      L-B3                                    5umol

标本核酸                                      20ng

添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;

步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;

步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。

进一步的，所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。

进一步的，所述外引物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。  

进一步的，所述内引物L-FIP的序列为

GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCC。

进一步的，所述内引物L-BIP的序列为TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。

进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。

本发明的有益效果是：

    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测单核细胞增生李斯特氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

具体实施方式

下面将结合实施例，来详细说明本发明。

 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X,MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M