[发明专利]利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域中花生四烯酸的制备方法，特别指经液体培养后的高山被孢霉菌体，粉粹后接种至固料培养基，培养繁殖大量孢子，再经液体发酵制备花生四烯酸的方法。

技术背景

花生四烯酸(ARA)是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液黏度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。过去商业ARA主要来源于猪肝和鱼油，但含量极低且不稳定，开发费用昂贵，难以满足社会的需求，特别是奶制品和制药行业所需的ARA量很大。八十年代初期，人们相继发现某些丝状真菌及微藻类含有花生四烯酸。由于微生物具有生长速度快、油脂及ARA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，利用微生物法生产花生四烯酸成为各国研究的热点。

高山被孢霉(Mortierella alpina)被认为是最佳的ARA生产菌株，它具有ARA含量高且PUFAs组成合理等特点。目前，利用alpina发酵生产ARA的研究主要集中在菌种选育、培养基优化等方面。研究一种从菌体培养出发，结合发酵过程定向调控，有效提高发酵水平的花生四烯酸制备方法是有市场前景的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，这种方法是高山被孢霉的种子培养方法，并结合适当的发酵工艺，以缩短其发酵周期，提高其产量质量。

本方法所使用的菌种为产花生四烯酸的普通高山被孢霉。

本发明制备孢子所采用的方法为菌体经液体培养后，收集菌体并粉碎，再接种至固料培养基。经液体培养后的成熟菌体，接种至固料培养基后能大量产生孢子。

本发明所用的产孢子培养基为固料培养基。该培养基的特征在于，以米糠、玉米粒为原料，添加适量的无机盐配制而成。

本发明在发酵培养调控过程中，所添加物质为柠檬酸三钠及一水柠檬酸。柠檬酸三钠呈碱性，柠檬酸呈酸性，在菌体大量繁殖生长阶段，使pH值稳定在6.0～6.5之间，有利于ARA菌体细胞的生长繁殖。而在ARA发酵产油阶段添加，能对pH值进行调节，使pH值稳定在7.5～8.0之间，有利于提高乙酰辅酶A羧化酶活性。乙酰辅酶A羧化酶催化的反应是脂肪酸合成过程中的限速步骤，是脂肪酸合成调控的关键所在。同时柠檬酸被菌体吸收，在细胞溶胶中，受柠檬酸裂解酶作用而断裂，生成乙酰辅酶A。而乙酰辅酶A是脂肪酸合成的关键起始物质。

本发明要解决的技术问题由如下方案来实现：将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养2天，在液体摇瓶中培养好的菌体通过过滤收集菌体，经无菌水洗涤，用电磨机粉碎成长度在1000～2000μm，再接种至灭菌好的固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，并摊匀物料，于28℃培养3～5天，培养期间，每24h时补水2mL以维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，将400mL无菌生理盐水倒入培养好的固料种子的克氏瓶中，充分振荡，以洗下孢子，孢子液按1.2％的接种量接入30L种子罐中进行放大培养，二级种子液再以10％的接种量接入100L发酵罐进行发酵生产花生四烯酸，所述液体摇瓶培养基：葡萄糖20～60g/L，酵母粉5～20g/L，硫酸镁0.1～1g/L，磷酸二氢钾0.1～2g/L；所述固料培养基：以米糠、玉米碎粒为原料，与浓度为1～3g/L磷酸氢二钾按10∶1～5的质量比混匀，在不锈钢锅内蒸煮30min后，摊开晾开表面水分，分装于1000mL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121℃灭菌30min。

具体步骤如下：

1、利用液体培养基培养高山被孢霉菌体：

①液体摇瓶培养基：葡萄糖20～60g/L，酵母粉5～20g/L，硫酸镁0.1～1g/L，磷酸二氢钾0.1～2g/L。培养基经121℃灭菌30min。

②将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至上述灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养2天。

2、收集上述培养好的菌体，粉粹后接种至固料培养基中：

①以米糠、玉米碎粒为原料，与浓度为1～3g/L磷酸氢二钾按10∶1～5的质量比混匀，在不锈钢锅内蒸煮30min后，摊开晾开表面水分，分装于1000mL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121℃灭菌30min制成固料培养基。