[发明专利]一种检测驼背鲈的引物对、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测驼背鲈的引物对、试剂盒及其检测方法。

背景技术

驼背鲈（Cromileptes altivelis）又称老鼠斑，是名贵的经济鱼类，市场需求量很大，价格特别昂贵。近年来随着人们生活水平的提高和需求的不断变化，名贵鱼类的消费发展极为迅猛，一些不法商贩频频通过错误标签、以次充好和虚假标注等手段牟取暴利，损害消费者的利益和健康，也使得食品成分、品质和质量安全等问题逐渐凸现。为保护消费者权益，需要确定产品所用鱼类的真实性和种类，建立可靠而准确的鱼类物种鉴定方法。

鱼类的物种鉴定，已从形态学方法发展到目前广泛应用的分子生物学方法。形态学方法是经典的方法，但只适用于完整形态的鱼样品，一旦进行了加工，如鱼片、鱼糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得困难，也会导致结果不准确。分子生物学方法包括蛋白质方法和DNA检测方法。蛋白质方法的缺点是不适用于加工食品，因为高盐、高热、高压等常见的加工方式会导致蛋白变性，从而使分析可靠性较低。而DNA检测方法则更稳定耐热，更特异，结果也更加灵敏和准确。目前在物种鉴定领域应用最广泛的DNA检测方法包括PCR及其相关技术 (如RFLP)和DNA序列分析等。PCR是通过扩增待测样品的 DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。目前，PCR方法已广泛应用于各个基因检测领域。

国内外学者对驼背鲈进行物种DNA鉴定的研究较少，国内外尚未见报道能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的PCR方法以及试剂盒。

因此，目前需要一种能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。

为实现上述目的，提供一种检测驼背鲈的引物对，具体为：所述引物对序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列。

本发明还提供一种试剂盒，含有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列引物对的试剂盒。

本发明保护了所述引物对和含引物对的试剂盒用于检测驼背鲈的用途。

本发明提供了一种用于检测驼背鲈的方法，其特征在于：包括用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒进行PCR扩增的步骤。

具体步骤为：

从样品中提取DNA为模板；

利用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

检测扩增产物，并作出判断。

所述的PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2.5 μL 10×PCR 缓冲液，2.5 μL 25 mmol/L的 MgCl₂，2.5 μL2.5 mmol/L 的dNTP，0.2 μL 5 U/μL 的DNA聚合酶，1 μL 10 μmol/L的上游引物Calf，1 μL 10 μmol/L的下游引物Calr，1 μL 样品基因组DNA，14.3 μL超纯水。

所述的PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸7 min。

所述的检测扩增产物并作出判断是采用电泳检测，出现275 bp左右的特异性扩增条带即判断为检出驼背鲈。

本发明引物对是通过分析已报道的驼背鲈线粒体细胞色素氧化酶I亚基（cytochrome oxidase subunit I，COI）基因序列设计。

本发明的引物对根据驼背鲈COI基因序列（Genbank序列号JF750765即SEQ ID No：3）和其他石斑鱼COI序列（Genbank序列号JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750763、JF750764）设计得到。

使用本发明的引物对，能够特异、灵敏地扩增出目的片段。