[发明专利]人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于诊断人乳头瘤病毒（HPV）感染的荧光PCR检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样本中HPV基因型以诊断其是否属于所述24个型中的某一种并判断为高危、中度高危和低危型，属于生命科学和技术领域。本发明的方法包括一个以荧光定量PCR为技术基础聚合酶链式反应（PCR），包含针对多种型别的正向引物、反向引物和探针，在特定PCR条件下可在一个反应管中同时检测HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24种型的DNA。

背景技术：

子宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤，主要发生于多产妇女的早期绝经期。每年全世界有约19万人死于子宫颈癌，而其中超过3/4的死亡发生在发展中国家。子宫颈癌的发生率在所有癌症中排名第七，而在妇女中排名第三，仅次于乳腺癌和大肠癌。在发展中国家，少于50％的患子宫颈癌的妇女能存活5年以上，而在发达国家，5年存活率是66％左右。 

在过去的10年中，估计全世界每年有将近371000例新的侵入性子宫颈癌，占到整个妇女癌症的10％。子宫颈癌高发病区主要位于中南美洲、南非、东非和加勒比地区，这些地区每年的平均发病率达到万分之四。东欧和北美的发病率低于每年万分之三，但在巴西东北部，发病率要比北美高10倍，一生中累积风险性可高达10％。

由于感染HPV是引起子宫颈癌的一大原因，所以现在这一研究已成为子宫颈癌预防的前沿学科。在西方工业化国家，对于所有的恶性肿瘤疾病，子宫颈癌也许是公共预防措施做得最好的例子。 

现有子宫颈癌的筛查技术可分两类，基于形态学的方法是在细胞或组织水平检查以识别不正常，基于分子生物学的方法是检查子宫颈上皮瘤的子宫颈癌的标志物。进一步区分这些方法可根据他们释放借助于显微镜或物理和电光学的特性。表1总结了当前各种子宫颈癌筛查的方法，而其中最关联或最有先兆的方法总结在如下几节。 

Pap细胞学：Pap检测是最早的癌症检测方法之一，毫无疑问，它同时也是现代医学中最有成效的一种方法。Pap检测主要是检查子宫颈癌先兆，通过重复检测，可以密切监测可疑的或低度异常，或提议病人立即进行阴道镜、细胞切片检查，并对高度或严重的损害进行治疗。通过Pap检测预防侵入性子宫颈癌，可在它还只是上皮组织时就阻止其恶性发展。 

薄层液相为基础的细胞学：ThinPrepTM和Autocyte Prep系统是两种基于液体的用于代替传统Pap涂片的制片方法。从子宫颈取得的样本被溶于细胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通过这种方法几乎所有的细胞都可给予检测。在传统Pap涂片法中，约20％从子宫颈收集的细胞会被置于玻璃片上，而在薄层样本中，多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，而含有约50000细胞的随机样本会由自动细胞处理机转移到玻璃片，并形成一薄层涂片，这涂片经染色后由细胞技术员进行检查。这种自动的薄层技术可以使涂片更清晰、均一，并且没有血细胞、炎症细胞碎片和细胞集落这些影响显微镜检测的因子， 从而提高对非典型细胞、癌症先兆和癌症的检出率。

自动化细胞学：自动化的系统正处于测试和市场推广的阶段。这些系统包括一种能自动把子宫颈癌细胞悬浮液制成标准薄层玻璃片的装置，及通过计算机辅助扫描来首先发现不正常细胞，并把这些涂片分离处理以便作进一步的人工细胞学检测。这些方法最关键的优点是可减轻因缺乏合格的细胞学家而引起的人员紧张。现在在北美和欧洲，有许多私人公司赞助的比较性实验正在验证这些自动化机器的筛查效率和经济效益。 

醋酸法目视筛查（VIA）：在低收入国家，目查法已成为一种技术要求低、能代替细胞学筛查的方法。这些目查法包括直接检查子宫颈，借助醋酸的目查法（也称为直接目查DVI,子宫镜和辅助目查），低倍镜醋酸目查（VIAM），Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宫颈图像。 

筛查中检查HPV：目前研究人员正在比较HPV检测与Pap检测作为子宫颈癌筛查方法的优缺点。由于HPV难以进行体外培养，而且不是所有的感染者都有可检测的抗体反应。因此，HPV DNA的检测是非介入式检测HPV感染最好方法。目前HPV检测的方法主要有三类：

第一类是直接探针结合，如southern印迹和点印迹，原位杂交过滤法等。这些方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐等缺点。