[发明专利]人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒，其特征在于：

该试剂盒含有：

DNA提取：NP-40；chelex100，TRIS-HCL；

DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶， UNG酶；

PCR反应液：dNTPs ，引物，DNA聚合酶Buffer；

PCR反应体系：DNA聚合酶选择Taq HS DNA聚合酶及引物探针：

PCR反应引物：

Taq-man探针：

阳性对照为人乳头瘤病毒16、11、66型基因组DNA；

内参为人肌动蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的一种人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光PCR法）试剂盒，其特征在于，探针5′端标记荧光基团为FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种，探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。

3.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列设计用于PCR扩增临床样本获得DNA的引物，上下游引物分别能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点杂交；

（2）根据各型HPV基因的特异性核酸序列中的序列设计的用于检测HPV的一组荧光探针，该探针能与靶序列上游的一个位点和下游的一个位点之间的一个位点杂交；

（3）使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的荧光探针的反应体系对HPV样品进行PCR扩增，一个反应体系中可针对一个或多个HPV基因的特异性核酸序列；

（4）采用多个不同的荧光对不同的探针进行标记，通过反应体系中荧光的变化检测样本中是否含有HPV DNA，以及HPV的类别。

4.根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，用于检测的荧光探针是Taqman探针，5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、ROX、CY3和CY5中的4种，探针3'端使用BHQ或TAMARA标记。

5. 根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，使用高温裂解后离心去除杂质的方法将HPV DNA制备成模板，在反应体系中进行扩增病毒的特异性片段，同时进行HPV的定量或定性检测，所使用的样本为妇女子宫颈脱落细胞或生殖道分泌物。

6. 根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，使用的方法为多重引物的PCR反应，其特征在于，由一对简并引物进行如下反应：模板变性，模板变性温度在95℃；引物退火及延伸，引物退火及延伸温度为52℃，反应体系满足Taqman探针退火温度低的缺陷；按模板变性-引物退火及延伸进行扩增，其循环数为35-45个。

7.根据权利要求3中所述的检测人类乳头瘤病毒（24型）核酸的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的引物对为一对简并引物，相距160～200个碱基，步骤（2）中所述的探针特异性针对24个型别HPV，并使用不同荧光标记，步骤（4）中所述的PCR反应的产物在同一样品管中同时检测24种HPV型别的DNA， 24种HPV型别是：HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52， HPV53，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73， cp8304，HPV83，HPVmm4，并根据致癌风险高低不同确定得到高危、中度高危或低危型HPV。