[发明专利]桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及将目的基因转入发根农杆菌后侵染桑树外植体，诱导出桑树转基因毛状根，建立一种桑树转基因毛状根高效诱导和繁殖体系的方法。

背景技术

桑树（Morus L.）属多年生木本双子叶植物，是应用于蚕桑产业一种重要的经济作物，是家蚕的唯一饲料来源；桑树在林业、食品行业也具有重要地位，桑叶中富含人体所需的多种氨基酸，其果实、根、茎、叶等都具有很高的药用价值和保健价值；同时，桑树能产生多种具有重要的药用价值的次生代谢物质，如槲皮素等黄酮类化合物及多种具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗衰老、预防肿瘤等功能的活性物质（李想韵，朱鸿，孙一铭，孙敏，桑遗传转化体系的建立及槲皮素合成的研究，中国中药杂志，2010，35（11））。

我国拥有世界上最多的桑树资源，但由于自然界生长的桑树遗传背景复杂，杂合性非常高，传统的遗传育种周期很长，并且很难做到对某个有价值遗传性状的定向育种。随着现代分子技术的发展，借助转基因育种，可以有选择地对桑树转入人为需要的某个基因，实现定向分子育种。但目前通过桑树愈伤细胞诱导后再分化而进行遗传转化存在周期长、转化效率偏低等问题（谈建中，楼程富，钟名其，平野久，大豆球蛋白基因表达载体的构建及对桑树的遗传转化，蚕业科学，1999，25（1））；而利用花粉介导转基因往往受到季节和桑树花性等因素制约。由于缺乏高效的桑树转基因技术体系支撑，国内外利用转基因技术进行桑树遗传育种的研究尚处于起步阶段；对桑树某些有价值的功能基因的鉴定和应用，以及对桑树多种有价值的次生代谢产物的研究也存在诸多困难。

发根农杆菌是在植物基因工程中广泛应用的一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，其携带的Ri质粒能有效侵染绝大多数双子叶植物，少数单子叶植物以及个别裸子植物，诱发植物产生形状如根系的发根即毛状根（hairy root）。由于发根农杆菌转化的毛状根具有生长速度快、分支多，能够持续合成次生代谢产物，获得的次生代谢产物量高且稳定、不需要添加外源植物激素等特点，因此可作为生产和研究植物次生代谢物质的生物反应器；同时，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，在定向分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在40多种植物建立了毛状根培养体系，特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用次生代谢产物生产及遗传育种研究。随着现代分子生物学的迅速发展，向桑树定向转入有价值基因，建立一套有效的桑树转基因体系已成为可能。尽管也有诱导野生型桑树毛状根的报道（孔卫青，杨金宏，卢从德，发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立，西北植物学报，2010，30（11）），但仍然存在诱导率偏低等问题（14-17％左右），并且目前未见将目的基因利用植物表达载体转入发根农杆菌，诱导的转基因毛状根，建立桑树转基因体系的报道。

AP2/ERF蛋白是植物特有的一类转录因子，在植物分子信号传导途径的级联反应中起到了关键性的作用，其表达水平的变化能在很大程度上影响植物对不良环境的适应能力（Zhi-Xin Qiao et al.Molecular cloning and functional analysis of an ERF gene from cotton （Gossypium hirsutum）.Biochimica et Biophysica Acta.2008，1779：122-127）。大量研究表明，ERFs参与植物的生长发育、环境适应和对各种胁迫因子作出的抗逆性反应，与植物次生代谢产物的形成有密切关系（Takeshi Fukao，et al.Ethylene-A key regulator of submergence responses in rice.Plant Science 2008，175：43-51）。而目前并无将AP2/ERF类转录因子或其他目的基因转入发根农杆菌，高效诱导桑树转基因毛状根并繁殖，建立桑树毛状根转基因体系的报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明将所选择的目的基因转入发根农杆菌，快速、高效诱导出含目的基因的桑树毛状根，对获得的转基因毛状根扩大培养并检测，建立一套高效的桑树毛状根转基因体系。

技术方案：桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，步骤包括：

（1）桑树无菌苗培养：选取桑树种子，或剪取野外生长的桑树顶芽，清洗消毒后置于MS培养基，26℃-28℃生长，培养一个月后得到桑树无菌苗，剪取无菌苗顶部叶片或茎段作为外植体；