[发明专利]桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法

权利要求书

1.桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤包括：

（1）桑树无菌苗培养：取桑树种子，或剪取野外生长的桑树顶芽，清洗消毒后置于MS培养基，26℃-28℃生长，培养一个月后得到桑树无菌苗，剪取无菌苗顶部叶片或茎段作为外植体；

（2）外植体预培养：将上述外植体置于事先配制的预培养基上培养36-48h；

（3）转基因侵染菌液制备：高保真酶扩增目的基因桑树乙烯转录因子MaERF1，将获得的目的片段与真核表达载体pBI121-eGFP连接后，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC158341感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基扩增至OD600=0.5时，添加乙酰丁香酮（AS），作为转基因侵染菌液；

（4）侵染与共培养：上述预培养的外植体置于转基因侵染液中浸染5-10min后，取出滤纸吸干，置于MS+50-300μMAS的共培养培养基中，26℃-28℃共培养36-48h；

（5）外植体除菌培养：共培养结束后，将外植体用无菌水清洗后转移至外植体除菌培养基MS+500mg/L头孢霉素+0.1％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+50-300μM AS，一星期后再转移至MS+250mg/L头孢霉素+0.1％PVP+50-300μMAS，直到侵染15天后出现桑树毛状根；

（6）桑树转基因毛状根的培养：剪取长度1cm的毛状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素除菌培养基，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入添加0-1.0mg/L吲哚乙酸的B5固体培养基扩大培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加0-1.0mg/L吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，繁殖结束。

2.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于还包括转基因毛状根检测步骤：分为分子检测和荧光检测两个部分，取毛状根，PCR方法检测农杆菌Ri质粒中RolC基因，判断是否为毛状根，再检测绿色荧光蛋白，验证是否是桑树转基因毛状根。

3.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（1）所述的桑树外植体为剪取所培养的高度达7-8cm桑树无菌苗顶端2-3cm处的幼叶或茎段作为外植体。

4.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（2）所述的预培养基为：MS+2.4-D 0.1-0.5mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+CaCl₂1.0-6.0g/L的预培养基，pH=5.0-5.8。

5.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（2）所述的预培养基优选为：MS+2.4-D 0.5mg/L+KT 1.5mg/L+CaCl₂4.4g/L，pH=5.4。

6.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（3）所述的转基因侵染菌液为：YEB液体培养基中添加的AS为50-300μM。

7.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（3）所述的转基因侵染菌液优选为YEB液体培养基中添加的AS为200μM。

8.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（4）所述的共培养培养基优选为MS+200μM AS。

9.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（5）所述的外植体除菌培养基优选为MS+500mg/L头孢霉素+0.1％PVP+200μM AS及MS+250mg/L头孢霉素+0.1％PVP+200μM AS。

10.根据权利要求1所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤（6）所述的B5固体和液体培养基优选添加的吲哚乙酸均为0.1mg/L。