[发明专利]一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类分子标记技术领域，涉及一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法。

背景技术

    罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和奥尼杂交罗非鱼等。由于不同品种的罗非鱼有很大的形态特征重叠，这使形态上鉴别不同罗非鱼品种非常困难。另外，罗非鱼品种间很容易杂交，且杂种可育，杂交种形态又与亲本很相似，因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼养殖业发展的突出问题。运用分子标记技术在DNA水平上寻找不同罗非鱼品种的差异，可以快速、准确鉴别不同罗非鱼品种，为罗非鱼的品种鉴定、种质保护等提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，包括以下步骤：

（1）采集待鉴别的罗非鱼的血液、鳍条或其他组织样品，采用DNA提取法提取基因组DNA；

（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行电泳检测；

（4）根据PCR的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼：尼罗罗非鱼电泳检测结果有1条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有1条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。

步骤（2）中，PCR扩增采用的正义引物序列为：5′AATAAAACAGTTGATGGTGA  3′，反义引物为：5′ AAATGAAGAAACGCCCTCTT  3′。PCR体系总体积20 μL，其中含10×反应缓冲液2 μL，Mg²⁺　2 mmol/L，dNTP　200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板 100 ng～200 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 50s，50℃退火 50s，72℃ 50min，30个循环；72℃ 延伸5 min，4℃保存。

步骤（3）中，电泳检测的方法可采用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。

本发明的有益效果：运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地同时将奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼区别开来。

附图说明

图1为奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其两者的杂交鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-8：奥尼罗非鱼

9-14：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)

15-20：尼罗罗非鱼(♂)×奥利亚罗非鱼(♀)

21-28：尼罗罗非鱼； 

图2为待检奥利亚罗非鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-36：待检奥尼罗非鱼

37-39：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)；

图3为待检尼罗罗非鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-36：待检尼罗罗非鱼

37-39：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)。

具体实施方式

下列实施例中基因组DNA参照文献提取（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著. 分子克隆试验指南 [M]. 3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京：科学出版社，2002：463-471）。

实施例1