[发明专利]用于基因定点修饰的TALE重复片段的高效合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术，具体地说涉及应用于基因（特别是真核基因）定点修饰的TALE重复片段的合成方法。

背景技术

TALEs(Transcription activator like effectors)在自然界中，是多种黄单胞菌属（Xanthomonas）产生的用于激活宿主基因表达或促进自身群落化的第三类分泌蛋白(Boch and Bonas,2010;Bogdanove et al.,2010;Scholze and Boch,2011)。有报道证明TALEs蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的关系，TALEs蛋白中含有高度保守、以33-35个氨基酸为单元组成的串联重复序列，每个单元中第12、13位氨基酸负责识别和结合特异的一位核苷酸序列(比如NI识别A,HD识别C,NG识别T，NN识别G以及A，等等)。通过这种关系，TALEs可以特异性结合靶点DNA(Boch et al.,2009;Moscou and Bogdanove,2009)。TALEs成功解决了锌指蛋白不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，是目前将效应蛋白带到特定核酸序列的最有效方法之一(Bogdanove and Voytas,2011)。基于TALE的这一特性，已经发展出多种应用，用于定点修饰或编辑真核基因表达，包括TALE-nuclease chimeras(TALENs)技术（用于基因敲除）(Miller et al.,2011)、TALE介导的特定基因的转录激活(Miller et al.,2011)或者抑制(Cong et al.,2012;Garg et al.,2012;Mahfouz et al.,2012)。

由于任一定制的TALE通常包含大约十个以上的高度重复片段（34a.a./段）,其表达载体的合成难度很大。在近期的研究中，已有多个科研机构利用这种氨基酸与核酸序列的对应关系，模块化组装TALEs，特异性结合目的核酸序列(Briggs et al.,2012;Cermak et al.,2011;Garg et al.,2012;Huang et al.,2011;Li et al.,2012;Li et al.,2011;Morbitzer et al.,2011;Reyon et al.,2012;Sanjana et al.,2012;Weber etal.,2011;Zhang et al.,2011)，但依然存在效率低、周期长、操作繁琐、前体材料种类繁多或花费大等各种不同的问题。

具体来说，2011年Tomas Cermak发表在Nucleic Acids Research上的文章借助亚克隆手段通过不同载体构建粘性末端，根据TALE的不同重复单元所处不同位置选择亚克隆的载体，通过酶切制造唯一位置上特异的粘性末端，这样就可以实现不同的重复单元按照一定顺序进行连接。由于受到连接效率和载体构建的限制只能设计1-10位置的重复单元，所以合成TALE只能分两步进行。另外，此方法准备工作非常复杂，至少需要五天时间(Cermak et al.,2011)。

Rene Geibler小组在上一方法的基础上建立了名为“Golden TALE Technology”的合成方法，将利用亚克隆制造特定位置粘性末端的载体数量缩减为六个，而优化了不同分组之间的克隆载体，从而实现更加高效率更加准确而又不延长时间的方法(Geissler et al.,2011)。

北京大学张博教授发表了一个名为“单元合成”的方法，该方法利用SpeI和NheI两个核酸酶的位点特性设计了两两一组的合成单元，此法准确性高，但是耗时较长(Huang et al.,2011)。

Bing Yang小组提出了名为“modular assembly”的合成方法，该方法利用密码子的简并性通过BsmBI酶切的方法使得每个重复单元可以获得八个不同的粘性末端，所以TALE合成就以位置互相区别的八个组的重复单元为基础进行，一定程度上提高了效率(Li et al.,2011)。以上方法均有各自不同的优缺点，但是同时面临的一个问题就是难以实现TALE的大批量生产。