[发明专利]用于基因定点修饰的TALE重复片段的高效合成方法

权利要求书

1.用于合成TALE重复序列的连接单体，所述连接单体为编码TALE重复序列的DNA片段，所述DNA片段两端具有尿嘧啶酶切位点。

2.根据权利要求1所述的连接单体，其特征在于，根据密码子简并性，除RVDs以外，所述连接单体编码相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的连接单体，其特征在于，所述连接单体经尿嘧啶酶切后，相邻两连接单体间具有唯一匹配的粘性末端。

4.根据权利要求1-3任一项所述的连接单体，其特征在于，其为以下引物的扩增产物：

下游引物任选SEQ ID NO 17-20、上游引物任选SEQ ID NO21-24，其中SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 21引物对除外；所述引物的DNA模板为SEQ ID NO 1-4任一所示；

或下游引物任选SEQ ID NO 25-28、上游引物任选SEQ IDNO.29-3，其中SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 29引物对除外；所述引物的DNA模板为SEQ ID NO 5-8任一所示；

或下游引物任选SEQ ID NO 33-36、上游引物任选SEQ ID NO37-40，其中SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 37引物对除外；所述引物的DNA模板为SEQ ID NO 9-12任一所示；

或下游引物任选SEQ ID NO 41-44、上游引物任选SEQ ID NO45-48，其中SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 45引物对除外；所述引物的DNA模板为SEQ ID NO 13-16任一所示。

5.由权利要求1-4任一项所述连接单体组装的二联体、三联体或多联体。

6.含有权利要求1-4任一项所述连接单体或权利要求5所述二联体、三联体或多联体的载体。

7.利用权利要求1-4任一项所述连接单体合成TALE重复片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）PCR扩增任意连接单体；

2）用尿嘧啶酶切试剂切割任意连接单体，再将切割的任意连接单体通过匹配的粘性末端相连；

3）重复采用步骤2）所述的酶切-连接的操作组装成含有任意重复单元、任意排列顺序的单体串联重复序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：Pfu Turbo Cx或Taq聚合酶，95°C变性30s；60°C退火20s；72°C延伸20s，30个循环。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用生物素-磁珠偶联的链霉亲和素进行DNA片段的连接。

10.权利要求1-4任一项所述连接单体、权利要求5所述三联体或权利要求6所述载体在基因敲除、基因敲入、过表达或抑制表达中的应用。