[发明专利]从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用，具体涉及从健康人体的血液中分离免疫细胞并冻存，以及在出现免疫低下或发生疾病症状时，将免疫细胞进行体外扩增并施用于患者进行免疫细胞治疗的方法。

背景技术

免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研究发现血液中蕴含丰富的淋巴细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价值。

免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来源成为一个重要的问题。

研究显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。

但是，目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离、保存和扩增免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术提取、冻存、复苏血液免疫细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞。本发明基于此发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了从健康哺乳动物的新鲜血液中获取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤：

(a)全血样本预处理：将血样本充分混匀，转移至离心容器中，稀释血液；

(b)Ficoll法分离：取离心容器，加入Ficoll细胞分离液，然后将稀释后的血液样本加入Ficoll细胞分离液的上层，将离心容器置于离心装置中，离心处理；

(c)单个核细胞(在本文中可用缩写MNC表示)收集和洗涤：离心处理结束后，将上层血浆转移至离心容器，吸取白膜层于离心容器内，补充生理盐水，混匀后再次离心处理，待细胞沉淀后洗涤两次，得到免疫细胞；

以及任选的下列步骤：

(d)针对步骤(c)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤：

(e)单个核细胞冻存：向步骤(c)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；

以及任选的下列步骤：

(f)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(e)的冻存免疫细胞进行关联。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤：

(g)细胞复苏：将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；

以及任选的下列步骤：

(h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤：