[发明专利]从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用

权利要求书

1.从血液中提取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤：

(1)全血样本预处理：将血样本充分混匀，转移至离心容器中，稀释血液；

(2)Ficoll法分离：取离心容器，加入Ficoll细胞分离液，然后将稀释后的血液样本加入Ficoll细胞分离液的上层，将离心容器置于离心装置中，离心处理；

(3)单个核细胞收集和洗涤：离心处理结束后，将上层血浆转移至离心容器，吸取白膜层于离心容器内，补充生理盐水，混匀后再次离心处理，待细胞沉淀后洗涤两次；

以及任选的下列步骤：

(4)针对步骤(3)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)加入的Ficoll细胞分离液与稀释后血液样本的体积比为1：10-10：1，优选2：7-7：2，优选3：5-5：3。

3.针对权利要求1提取的免疫细胞进行冻存的方法，该方法包括以下步骤：

(5)单个核细胞冻存：向步骤(3)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；

以及任选的下列步骤：

(6)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(5)的冻存免疫细胞进行关联。

4.根据权利要求3的方法，其中步骤(5)所述的冻存液是按照20-60重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，优选X-VIVO无血清培养基的配方量为30重量份、40重量份或50重量份，优选人血清白蛋白的配方量为20重量份、30重量份或40重量份，优选DMSO的配方量为8重量份、10重量份或12重量份。

5.针对权利要求3冻存的免疫细胞进行复苏的方法，该方法包括以下步骤：

(7)细胞复苏：将步骤(5)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；

以及任选的下列步骤：

(8)针对步骤(7)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

6.针对权利要求5复苏的免疫细胞进行扩增的方法，该方法包括以下步骤：

(9)用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞(iDC)，添加培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。