[发明专利]一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于多糖组分分析领域，具体涉及一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法。

背景技术

云芝糖肽是从担子菌纲云芝Cov-1菌株的液体发酵菌丝体中提取得到的一种中成药，其活性成分为结合蛋白多糖，临床研究证明云芝糖肽具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、促进受损肝细胞恢复等作用，用于食管癌、胃癌及原发性肺癌患者放、化疗所致的气阴两虚、心脾不足证。云芝糖肽是一类天然高分子有机物，其结构复杂多样。云芝糖肽国家标准WS3-228（Z-047）-2003（Z）中记载了多糖含量测定、蛋白含量测定等主要质控指标。其中，多糖含量测定是采用分光光度法，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)作为多糖含量的测定指标，不得少于38.0％。可见，我们目前缺乏监控云芝糖肽中多糖组分的专属性方法。

如今，市场上来源于云芝的产品较多，不仅有以云芝Cov-1菌株的菌丝体为原料制备而成的云芝糖肽，还有以其他云芝菌株菌丝体为原料的云芝胞内糖肽以及以云芝子实体为原料制备而成的云芝多糖。由于原料不同以及提取工艺的差异导致不同产品质量的巨大差异，临床疗效也各不相同，如云芝糖肽的适应症是肿瘤，云芝胞内糖肽和云芝多糖的适应症主要是肝炎。然而由于现有云芝糖肽质量标准中检测方法缺乏专属性，尚不能有效区分采用不同原料和不同工艺制备而成的多糖肽类产品。

目前单糖组分色谱分离测定的方法有气相色谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法。但是各种色谱方法均存在一定的不足之处。气相色谱法是测定单糖组分的经典方法，由于糖本身没有足够的挥发性，所以必须在色谱分析之前预先进行乙酰化或硅烷化衍生化处理，将糖转化成挥发性强的衍生物。从而导致单糖组分在衍生化过程中发生异构化，产生的异构化衍生物影响了组分的分离及定量。薄层色谱法虽然比较简单，但是由于存在灵敏度低的缺点，有些含量低的单糖不易检测出来。采用HPLC检测单糖的难点也在于单糖不具有紫外吸收的基团，因此必须先对单糖进行衍生化处理，使它带上能紫外吸收的基团，才能进行分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法，曾被尝试用于云芝糖肽中单糖组分的分析，虽然采用了非常复杂的梯度洗脱法也未能实现D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖三种单糖的有效分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，从云芝糖肽中有效分离出8种单糖组分，得出该8种单糖间的摩尔比。

本发明所采用的检测方法为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法，通过如下步骤实现：

（1）HPLC色谱条件与系统适应性试验；

（2）单糖组分测定，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中分析得到色谱图，并根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比；所述对照品溶液为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖对照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供试品溶液为云芝糖肽酸水解产物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。

所述步骤（1）中的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分比为16-20％，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH值为6.8-7.2；紫外检测器检测波长为250-260nm，理论塔板数按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物计算不得低于2000，为2000-20000。

优选的，所述磷酸缓冲液的浓度为0.03-0.07mol/L，pH值为6.9-7.1。

所述步骤（2）中混合对照品溶液液的制备方法是，将D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖和L-鼠李糖的对照品溶解于水；在对照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加热，糖的总量与NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩尔比为1：35-40：47-55；冷却后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl与所述NaOH的摩尔比为1：1；烘干、萃取、取水相过滤，即得混合对照品溶液。