[发明专利]淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤试剂制备领域，尤其涉及一种抗肿瘤试剂淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的生产工程菌株构建方法及它们的制备方法。

背景技术

链黑菌素是一个由绒毛链霉菌（Streptomyces flocculus）产生的具有独特喹啉环结构的抗肿瘤抗生素。其抗肿瘤活性良好，是一种广谱抗肿瘤抗生素，对脑癌、颈癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌，特别是对白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的疗效。链黑菌素的药理作用是：可选择性地抑DNA合成，主要作用于S期，一个分子的链黑菌素可与2000个分子的脱氧核苷酸稳定地结合，并能使瘤细胞染色体断裂，使已形成的DNA降解.由于具有较大的骨髓毒性，因此很少单独用药用于临床。链黑菌素含有四个环，其中三个环几乎处于同一个平面，而第四个环与这个平面几乎呈垂直状态。

淡紫醌霉素（lavendamycin）是从链霉菌（S.lavendulea strain C22030）分离鉴定的氨基醌类化合物，具有与链黑菌素相类似的结构，但是其化学结构含有五个环，这五个环几乎处于同一平面。淡紫醌霉素具有与链黑菌素相近的抗肿瘤活性和抗肿瘤谱，但是比链黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被报道以来，仅仅只有一例关于其产生菌的报道，目前该产生菌被国外公司保存，且产量低，文献报道在8升发酵培养基中仅获得0.3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯则是淡紫醌霉素利用化学合成手段通过与甲醇发生酯化反应获得的抗生素，目前并没有天然微生物产生淡紫醌霉素甲酯的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利用链黑菌素产生菌通过生物技术操作制备淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的方法。链黑菌素产生菌Streptomyces flocculusCGMCC4.1223的菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，寄存来源是上海医药工业研究院。参考文献：中国科学院微生物研究所放线菌分类组，《链霉菌鉴定手册》，1975,P202-205,科学出版社，北京。本发明通过对柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223进行针对链黑菌素生物合成基因簇中双氧化酶的选择性失活突变，得到相应的双氧化酶失活突变菌株，从该突变株的发酵液中分离到淡紫醌霉素（lavendamycin）及其甲酯化合物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种淡紫醌霉素的制备方法，包括如下步骤：

A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；

B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活，获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl；

C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9～10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液；

D、调整所述水相滤液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得。该淡紫醌霉素，其结构式如式（Ⅰ）所示：

优选地，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。

优选地，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3～2:1。

优选地，步骤D中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与水相滤液的体积比为1:3～2:1。

优选地，步骤D中，所述纯化为：用pH值为11～13的碱性水溶液溶解所述粗提物B并离心，收集上清液；向上清液中滴加盐酸至出现沉淀；离心弃去上清，沉淀冻干后加入乙腈溶解，经半制备性PHLC（ZORBAX XDB-C18,9.2*250mm，5A粒径）色谱,以乙腈水溶液洗脱，接收对应的吸收峰，合并馏分后放置-20℃以下，待有沉淀析出后低温离心，弃去上清，冻干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。

优选地，所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为20%～100%。

优选地，所述碱性水溶液为0.1～1M NaOH溶液。

第二方面，本发明还涉及一种淡紫醌霉素甲酯的制备方法，包括如下步骤：

A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；