[发明专利]淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法

权利要求书

1.一种淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；

B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活，获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl；

C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9～10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液；

D、调整所述水相滤液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得。

2.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。

3.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3～2:1。

4.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与水相滤液的体积比为1:3～2:1。

5.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述纯化为：用pH值为11～13的碱性水溶液溶解所述粗提物B并离心，收集上清液；向上清液中滴加盐酸至出现沉淀；离心弃去上清，沉淀冻干后加入乙腈溶解，经半制备性PHLC,以乙腈水溶液洗脱，接收对应的吸收峰，合并馏分后放置-20℃以下，待有沉淀析出后低温离心，弃去上清，冻干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。

6.如权利要求5所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为20%～100%。

7.如权利要求5所述的淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，所述碱性水溶液为0.1～1M NaOH溶液。

8.一种淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；

B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活，获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl；

C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9～10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，保留中等极性有机溶剂相A，浓缩得到粗提物A，对所述粗提物A进行纯化，即得。

9.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。

10.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3～2:1。

11.如权利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述纯化为：将粗提物A用正相硅胶柱层析，以石油醚和中等极性有机溶剂B的混合物作为流动相洗脱，经HPLC分析检测，合并含有淡紫醌霉素甲酯的馏分并浓缩，然后用反相硅胶进行柱层析，用甲醇水溶液洗脱，将所得到的馏分经HPLC检测后合并馏分，浓缩干燥，得淡紫醌霉素甲酯。

12.如权利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述作为流动相的石油醚和中等极性有机溶剂B的体积比为1:3～10:1。

13.如权利要求11或12所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述中等极性有机溶剂B为乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或异丙醇。

14.如权利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为60%～100%。