[发明专利]一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别金银花和山银花药材的方法及其应用。

背景技术

金银花（Flos Lonicerae Japonica）为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。山银花（Flos Lonicerae）为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz．、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.成黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S．C．Cheng的干燥花蕾或带初开的花。金银花和山银花都是常用的名贵中药材，在临床上都有广泛的应用，具有清热解毒，疏散风热之功效，但两者在药效成分含量上不同，功效也各有侧重，而且它们的性状极为相似，用传统方法极难把二者区分开，药典中采用的性状鉴别的方法具有一定的主观性，而且必须要求药材外形完整，无损伤，可操作性不强，同时鉴别者需要有丰富的专业知识和鉴别经验。目前市场上出现了金银花和山银花混用的情况，在一定程度上影响了用药的质量和安全。针对这种情况，急需寻找一种稳定、可靠、简易地方法用于快速鉴别金银花和山银花药材或粉末。

发明内容

本发明目的是提供利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别金银花和山银花药材的方法。

由于金银花和山银花药材都是干燥的花蕾和初开的花，它们的DNA可能已经发生了一定的降解，而且金银花和山银花都含有较多的多糖，本发明提供的金银花和山银花药材DNA提取方法，可高效、快速提取金银花和山银花药材的DNA。

具体包括以下步骤：取金银花、山银花药材，在基因组DNA提取前加入5%的PVP40粉末。

本发明提供的金银花和山银花药材的核糖体DNA的ITS2快速PCR扩增方法主要针对其序列GC含量高的特点，可通过提高退火温度和加入5%的二甲基亚砜和2%的三甲基甘氨酸成功扩增金银花和山银花的ITS2序列。

本发明提供的金银花和山银花的鉴定方法，包括PCR扩增ITS2基因。具体包括如下步骤：

（1）提取待测样品DNA，

（2）PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列的片段；

（3）对扩增产物进行双向测序，拼接，去除序列两端的5.8S和28S基因区段，获得完整ITS2基因间隔区。

本发明所用扩增引物序列为：

ITS2-HF    5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’

ITS2-HR    5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’

所述PCR扩增的体系为每25μL：

10×PCR Buffer2.5μL，25mmol/L Mg²⁺2μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，2.5μmol/L引物各1.0μL，DNA模板30ng，Taq DNA聚合酶1.0U，5%的二甲基亚砜1.0μL，2%的三甲基甘氨酸0.5μL，补灭菌双蒸水至25μL。

所述PCR扩增的条件为94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。

（4）基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树，通过NJ树可以直观的鉴别金银花和山银花。

本发明所述方法可应用于鉴定忍冬属植物。所述忍冬属植物优选为金银花、山银花。

本发明的有益效果：

（1）本发明提供的金银花药材核糖体DNA的ITS2片段制备方法可有效解决金银花药材的品种鉴定、品种改良、育种，以及种质资源的开发利用等问题。

（2）本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高。能够成功实现对金银花和山银花药材或粉末的快速、准确鉴定。

附图说明

图1为加入5%的二甲基亚砜1.0μL和2%的三甲基甘氨酸0.5μL的PCR反应体系中，金银花和山银花ITS2序列的PCR扩增电泳图；M为分子量标准；1、26为阴性对照；2-25为金银花；27-31为灰毡毛忍冬；32-36为黄褐毛忍冬；37-38为红腺忍冬；39-40为华南忍冬；