[发明专利]用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，特别涉及到一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途。

背景技术

γ-聚谷氨酸(Poly(γ-glutamic acid),γ-PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，分子量在100-1000kDa之间。γ-聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性；这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外，γ-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子，还具有一些独特的优良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此，其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域；作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域；作为热塑性材料、水凝胶等应用于工业和农业领域；作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域；作为保湿剂应用于化妆品领域。

γ-聚谷氨酸于1937年由Ivánovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Ivánovics and Bruckner1937;Ivánovics and Erdōs1937)；并在1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中（Bovamick1942）。由此，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的γ-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。尤其是近十年来，国内外对微生物发酵生产γ-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前，日本和韩国已进行了工业化试生产。国内开展γ-聚谷氨酸的研究相对较晚，一些科研院校主要对γ-聚谷氨酸产生菌筛选、发酵工艺优化、分批发酵生产等进行了研究，取得了一些可喜的研究成果。

γ-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展，菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高，但是菌株发酵周期长、生产效率低、发酵工艺成本高等严重制约了γ-聚谷氨酸发酵工业化的进程。因此，寻找具有优良发酵特性的γ-聚谷氨酸产生菌具有重要的生产意义。

海沙是由岩石经过风和水的侵蚀和冲刷形成的小颗粒，主要成分是二氧化硅。广西北海海沙因长期浸于高盐浓度的海水中，且广西北海地处亚热带地区，日照时间长，海沙长期处于高温日照条件下，因此从这种海沙样品中可分离到一些较其他材料来源发酵特性更加优良的菌种，如耐高盐、耐高温菌种。

目前用于生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分离菌种材料大多来源于土壤、豆腐乳、酱萝卜条、酱黄瓜、酱大蒜、豆酱、西瓜酱、酱菜、腊肠、豆鼓、纳豆、腊肉，关于以海沙为分离菌种材料，尚未有公开文献报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途，本发明的枯草芽孢杆菌是从海沙中分离得到，可在较高温度下高效合成γ-聚谷氨酸，最高温度可为50℃，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l·h，具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCC NO：M2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。

以上所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28的培养方法包括如下步骤：

（1）制备菌悬液：将海沙样品接入装有80～120ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中，室温下磁力搅拌25~40分钟，制成菌悬液，于90~110℃处理8~15min；

（2）菌悬液稀释、菌落挑取：将步骤（1）的菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，选择10⁵、10⁶和10⁷倍的菌悬液100μL涂布于固体分离培养基平板上，45~60℃恒温培养20~25h后，挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落；

（3）划线纯化：用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，挑取少量步骤（2）中的单菌落，在固体分离培养基平板上连续划线，将划线后的平板至于45~60℃恒温培养15~20h后，挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面，经培养后保存；