[发明专利]一种树突状细胞疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种树突状细胞疫苗制备方法。

背景技术

DC名为树突状细胞，它是机体重要的免疫细胞，在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景，在特异的肿瘤抗原刺激下，成熟的树突状细胞能表达多种细胞因子和趋化因子，如，MHCⅡ分子HLA-DR，共刺激分子CD80，CD86 等多种细胞因子，有效诱导抗原特异性和非特异性免疫应答反应，增强机体免疫功能。但DC在人外周血中比例很低，因此提高扩增倍数，增加成熟的树突状细胞数，对治疗效果起着关键的作用。

现在树突状细胞做的很热，常规技术是用GM-CSF+IL4，这种方法的扩增倍数不高，成熟度不高，一般成熟的树突状细胞数只能达到2×10⁶，成熟的树突状细胞纯度在60%，参见图1。也有采用加入Flt3来进行扩增的，但其中还会加入化学药物，而且扩增倍数及成熟度也并不高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于肿瘤治疗用的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，有效提高树突状细胞扩增，使人PBMC中未成熟的树突状细胞在体外培养条件下扩增倍数提高，提高成熟度，且不添加化学药物，纯净度高。

为实现上述目的，设计一种树突状细胞疫苗制备方法，其特征在于采用如下制备步骤：（1）取17ml病患自体血，采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、血浆；（2）用GT-T551无血清培养基调整单核淋巴细胞浓度为2×10⁶个/ml；（3）将调整好浓度的单核淋巴细胞以3ml/孔加入6孔板中，贴壁16小时；（4）吸弃6孔板的每个孔内的上层未贴壁细胞，在每个孔的下层即留下未成熟DC细胞；（5）再在6孔板的每个孔内分别加入DC培养基3ml，置于二氧化碳培养箱内，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃，培养2～3天；（6）吸弃6孔板的每个孔内DC培养基一半1.5ml，每个孔内再补充DC培养基1.5ml，进行半量换液；（7）以第一次加入DC培养基开始计算的第6天，荷载自体肿瘤抗原，使6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20μg/ml；（8）24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度；所述的DC培养基由上述步骤（1）中分离出的自体血浆、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551无血清培养基所组成，其中自体血浆占整个DC培养基体积的1％，GM-CSF占整个DC培养基的浓度为50ng/ml，IL-4占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，Flt3占整个DC培养基的浓度为100ng/ml，GT-T551无血清培养基占整个DC培养基体积的96%。

本发明同现有技术相比，分离出的自体血浆再利用，用人血浆替换为离体的人AB血清；在该DC培养基中加入Flt3，可以增强刺激树突状细胞扩增倍数，成熟的树突状细胞数至少达到1×10⁷，成熟树突状细胞的成熟度＞85%；解决了树突状细胞制备过程中细胞数量少，增殖慢的问题；用自身特异的肿瘤干细胞裂解液，作为肿瘤抗原，细胞的特异性杀伤力更强；且原料不添加额外的化学药物，纯净度高。

附图说明

图1为原有的方法制备出的成熟的树突状细胞的纯度图。

图2为采用本发明制备出的成熟的树突状细胞的纯度图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步地说明。

（1）取18ml病患自体血，取其中1ml病患自体血做流式细胞检测，用于治疗前免疫指标的评价，另外17ml病患自体血采用人淋巴细胞分离液分离出红细胞、单核淋巴细胞、血浆；

（2）用GT-T551无血清培养基调整单核淋巴细胞浓度为2×10⁶个/ml；

（3）将调整好浓度的单核淋巴细胞以3ml/孔加入6孔板中，贴壁16小时；

（4）在6孔板的每个孔内吸弃上层非贴壁细胞，在每个孔内即留下下层贴壁的未成熟的DC细胞；

（5）再在6孔板的每个孔内分别加入DC培养基3ml，置于二氧化碳培养箱内，其中CO²浓度为5％，温度为37℃，培养2～3天；

（6）吸弃6孔板的每个孔内的DC培养基1.5ml，再另取1.5ml 的DC培养基放在每个孔内；

（7）以第一次加入DC培养基开始计算的第6天，荷载病患自体肿瘤抗原，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗，其中6孔板的每个孔内的自体肿瘤抗原的浓度为20μg/ml；

（8）24小时后检测成熟DC细胞的数量和成熟度。