[发明专利]一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及基因组DNA的提取方法，特别涉及一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用。

（二）背景技术

DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，在诸如基因组测序、Southern杂交、PCR扩增、构建BCA文库、分子克隆等常规实验中，获得高分子量、高纯度的基因组DNA是开展研究工作的重要前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行检测、诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段；尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对所提取基因组DNA的完整性及纯度要求更高。血液取材方便可靠，因此许多研究均以血液作为材料以提取完整的基因组DNA。而出于对实验成本、工作效率等多方面因素的考虑，研究人员希望尽可能一次性获取最大采血量(2-10ml)的基因组DNA，以进行长期保存，满足长期、反复、多种研究的需要。

基因组DNA提取一般需遵循以下几个原则：1、保证提取的DNA具有一定的长度；2、纯化后不应存在对没有抑制作用的物质；3、排除有机溶剂和金属离子污染；4、蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。对于范围在2-10ml血样的基因组DNA提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。目前市场上商品化的离心柱型试剂盒操作简单，但一般只能满足微量全血（100-500ul）的提取需求，而对于中大量血液的基因组提取，则操作中会包含反复的移液、离心，易造成样本的交叉污染。

磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法。磁珠是指直径几十纳米至数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或者无机/无机材料组成的外形呈现为球状的复合粒子。运用此法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量大。专利号为200810200588.X、200910223901.6、200910307632.1、201110124322.3的专利分别公开了利用磁珠提取核酸的试剂盒或者方法，但都只是针对血液或其他来源样本中的病毒核酸所设计，并未涉及到血液基因组DNA 的提取；专利号20101035963.4的专利公开了“一种用磁珠分离基因组DNA的试剂盒及其应用”，其应用主要针对于从动植物组织中提取基因组DNA；专利号201010153890.1的专利公开了一种“血液基因组磁珠小提试剂盒极其提取方法”，此试剂组成和方法，只适用于小样本量（50-200ul）血液的基因组DNA提取，对于大体积样本的提取，则容易受到红细胞及血液其他组分的干扰和污染，无法适用于对基因组需求量较大的试验研究，这也是目前国内市场上磁珠法全血基因组试剂盒所面临的技术瓶颈。 

因此，提供一种可从大体积全血样本中提取基因组DNA的方法和试剂盒，并且操作简单、成本低廉、提取的基因组产量高、质量佳，对于满足临床诊断和研究人员对样本长期保存、反复使用的需求是很有必要的。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种利用磁珠提取中大量全血基因组DNA的方法和试剂盒，特别针对较大样本量（2-10ml）的全血材料，经过对血液组分的简单处理，即可去除大部分杂质，利用单分散磁性微球特异吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤，即可获得产量高、纯度好、片段完整的基因组DNA，适用于PCR检测、酶切反应、分子杂交、测序等下游实验。

本发明采用的技术方案是：

一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述磁珠悬浮液以氯化铁和氯化亚铁为磁性材料，在氮气和氢氧化钠的作用下，通过化学共沉淀形成磁性粒子，再将磁性粒子用硅酸钠修饰，水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液1、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；

所述红细胞裂解液终浓度组成为：100~200mmol/L氯化铵、5~20mmol/L钾盐，0.05~ 0.1mmol/LEDTA，溶剂为水，pH为7.0~8.0；

所述细胞裂解液终浓度组成为：50 ~ 200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐a、50~100mmol/L螯合剂、500 ~ 800mmol/L钠盐和质量终浓度0.5~5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为7.0~8.0，所述螯合剂为EDTA（乙二胺四乙酸）；