[发明专利]一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗炭疽单抗的基因和基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备炭疽治疗药物中的应用。

背景技术

炭疽是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus Anthrax)引起的人畜共患重大烈性传染病。在世界范围内具有广泛的分布。根据感染途径不同，人类炭疽分为皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽三种原发类型。在我国，肺炭疽因为病死率高而作为I类传染病进行管理。炭疽芽孢杆菌包含两个主要的毒力因子：以γ键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜(PGA)和由三种蛋白组分构成的炭疽毒素。其中荚膜能阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽毒素由细菌质粒POX1编码，包括三种蛋白质成分：保护性抗原(Protective antigen，PA)、致死因子(Lethal factor，LF)和水肿因子(Edema factor，EF)。其中PA能诱导机体的保护性免疫，是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed，AVA)的主要免疫活性成分。LF具有金属依赖的蛋白酶活性，能够分解MAPKK(mitogen-activated protein kinase kinase，有丝分裂原激活蛋白激酶激酶)并使巨噬细胞溶解；EF具有钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶活性，可使靶细胞内环磷酸腺苷浓度升。致宿主细胞内信号通路损伤，防御能力下降，打破体液平衡导致水肿。实验证实，炭疽毒素是一种AB(active-binding)的模式。PA是复合物中的“B”，与细胞膜上的炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor，ATR)——肿瘤肉皮细胞标志8(TEM8)或2型毛细血管形成蛋白(CMG2)结合，由位于细胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)发生寡聚化，在膜上形成七聚体((PA63)₇)。LF和EF是“A”，能够结合七聚体形成的复合物通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF和LF进入胞液，分别发挥毒性作用。这三个蛋白本身都是无毒的，但PA和LF的混合物称为致死毒素(Lethal toxin，LT)，可以导致实验动物的致死性休克。PA和EF的混合物称为水肿毒素(Edema toxin，ET)，在注射处可引起水肿。

炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前有效的预防措施主要是接种炭疽疫苗，接触前1～2个月进行预防性接种，能为人员提供免疫防护。有效的治疗措施主要有二大类：一类是炭疽杆菌的抑菌剂和杀菌剂，其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分；另一类是依据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂。

目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出现以下情况，临床上往往不能奏效。

1、未能及时服用抗菌素：抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽孢后的48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗。但炭疽感染的潜伏期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊，错过最佳治疗时机；

2、人体产生耐药性：抗菌素滥用是目前严重的世界公共卫生问题，一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；

3、炭疽杆菌人为改构：将抗菌素抗性基因导入炭疽杆菌，使外用抗菌素失效，这在现今基因操作技术上已完全可能。

抗菌素对吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用，抗菌素只能杀死人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌，却不能抵抗孢子和细菌在体内产生的大量毒素，而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中和单抗因为具有保护性高，半衰期长，性质稳定等优点，成为目前最有前景的炭疽毒素抑制剂。不管是抗菌素还是中和单抗，单独用药均存在不足，设想在特殊情况下，联合应用抗菌素和中和性单抗可以相互弥补，最大可能的发挥治疗作用。目前单抗和抗菌素联合用药处于临床研究阶段。Pharmathene公司2009年开展的环丙沙星和Valortim(单抗)以及Doxycycline和Valortim(单抗)联合用药的1期临床试验。