[发明专利]一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术。

背景技术

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。

基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和 Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

但是，通常基因芯片在检测之前，需要对从样品中获取的DNA/mRNA样品必须进行扩增提高阅读灵敏度。在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。而且，在扩增过程中由于DNA的序列差异，所掺入的荧光标记的dCTP不一致，在同样条件下，G/C含量高的DNA信号明显强于G/C含量低的DNA。在芯片检测之前，PCR产物与芯片上的探针进行杂交，所需时间长，不同分子所需杂交条件不一致，误差大，且由于杂交位于固相表面，所以有一定程度的空间阻碍作用。样品制备上，当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题，这包括 Mosaic Technologies 公司的固相 PCR 扩增体系以及 Lynx Therapeutics 公司提出的大量并行固相克隆方法，两种方法各有优缺点，但目前尚未取得实际应用。

链置换等温扩增技术是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法，即，具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的，在延伸新链的同时将下游旧链剥离的一种新的扩增方式。

分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。在长度为15-30 mer寡核苷酸探针的两端分别加上5-8 mer序列互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区互补序列的结合使探针分子形成发夹状结构，所以又被称为发夹探针。探针的5'端及3'端分别标记荧光素分子及淬灭剂分子。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10 nm)，此时发生荧光共振能量转移，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和淬灭分子距离增大，荧光分子所产生的荧光不能被淬灭分子所吸收，发射荧光。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术

本发明所采用的技术方案是：

一种采用分子信标链置换等温扩增基因芯片检测目标DNA/RNA的方法，包括如下步骤：

（1）分子信标的设计：分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中，环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8～25个碱基，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区连接环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标3’端修饰有荧光分子； 

（2）芯片点样与链置换等温扩增反应：将分子信标5’端固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将淬灭探针及样品DNA/RNA与芯片进行杂交，洗涤，然后将链置换等温扩增反应液、引物加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；

或者是：将分子信标与淬灭探针混合，点样固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将链置换等温扩增反应液、引物及样品DNA/RNA加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；

所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少有8个碱基与5’茎杆区延长段互补，优选为12个碱基；所述引物与3’茎杆区互补；