[发明专利]一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术及试剂盒

权利要求书

1.一种采用分子信标链置换等温扩增基因芯片检测目标DNA/RNA的方法，包括如下步骤：

（1）分子信标的设计：分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中，环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8～25个碱基，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区连接环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标3’端修饰有荧光分子； 

（2）芯片点样与链置换等温扩增反应：将分子信标5’端固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将淬灭探针及样品DNA/RNA与芯片进行杂交，洗涤，然后将链置换等温扩增反应液、引物加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；

或者是：将分子信标与淬灭探针混合，点样固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将链置换等温扩增反应液、引物及样品DNA/RNA加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；

所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少有8个碱基与5’茎杆区延长段互补；所述引物与3’茎杆区互补；

（3）对扩增结果进行荧光数值分析，根据荧光值，确定样品DNA是否为目标DNA及其含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分子信标的环状区为长度15～30个碱基的序列；5’茎杆区和3’茎杆区的互补序列长5～11个碱基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信标的5’端连接有10～30个胸腺嘧啶或腺嘌呤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信标的5’末端修饰氨基，固相支持物表面修饰醛基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分子信标3’端标记的荧光分子为FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、PE、TAMRA、ROX、Texas Red、AMCA、JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye等有机荧光染料或量子点等无机染料中的任一种；淬灭探针上的荧光淬灭基团为P-苯二胺(Para-phenylene diamine，PPD)、n-丙基没食子酸盐（propyl gallate，NPG）、1，4-二偶氮双环（2，2，2)-辛烷(1，4-diazobicyelo(2，2，2)-octane，DABCO)、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Iowa Black、纳米金颗粒中的任一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持物为玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述链置换等温扩增反应液的组成为：50mM Tris-HCl pH 7.0~8.0，1.5 mM MgSO₄，10 mM二硫苏糖醇（DTT），50～400 μM每种dNTP，20 μg/ml BSA，25～100 U/ml DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可在链置换等温扩增过程中，所加入的dCTP用荧光标记。

9.一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测试剂盒，包括固定在固相支持物表面的分子信标、淬灭探针、引物、链置换等温扩增反应液，其中：

所述分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8～25个核苷酸，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区靠近环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标的3’端修饰有荧光分子；

所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少8个碱基与5’茎杆区延长段互补；

所述引物与3’茎杆区互补。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述链置换等温扩增反应液的组成为：50mM Tris-HCl pH 7.0~8.0，1.5 mM MgSO₄，10 mM二硫苏糖醇（DTT），50～400 μM每种dNTP，20 μg/ml BSA，25～100 U/ml DNA聚合酶。