[发明专利]一种卵巢透明细胞癌诊断试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种辅助卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择的HNF1B基因状态荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含GSPHNF1B探针和17号染色体着丝粒探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP HNF1B和CSP17探针的使用量均为0.5μl。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为Human COT-1DNA。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

5.一种制备权利要求1试剂盒所述HNF1B基因探针和17号染色体着丝粒探针的方法，如下：

(1)片段筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有HNF1B基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择含有HNF1B基因最优的克隆，编号为CTD-2257N17(chr17：36033624..36152533)；通过NCBI Mapview数据库检索17号染色体重复区域序列，并进行重复性分析，选择引物设计区域；

(2)培养鉴定：按照HNF1B筛选确定的克隆编号购买克隆(Invitrogen)，常规培养，使用针对HNF1B基因区域的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选HNF1B克隆的鉴定；CSP17以人基因组DNA为模板，利用设计的引物对进行PCR反应，通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，从而完成待选CSP 17片段鉴定；

(3)探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；

(4)探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于包含HNF1B基因片段的克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为：上游引物5’-TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’和下游引物5’-TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于制备CSP17探针的引物对序列为：

上游引物5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’和下游引物5’-AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3’；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针制备过程中50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针标记的荧光素为荧光素标记Spectrum dUTP。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或Human Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。