[发明专利]转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法

权利要求书

1.一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

（1）金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的克隆

提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，采用Primer Premier 5.0软件，设计金鱼草Delila和Rosea1基因编码框的上游引物、下游引物，并在金鱼草Delila基因的上游引物前引入BamH I限制性酶切位点和保护碱基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位点和保护碱基CAGGAGCTC，金鱼草Delila  基因上游引物序列为Delila-F：5’-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3’，下游引物序列为Delila-R：5’-CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’；在金鱼草Rosea1基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GA AGATCT，在下游引物前引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，金鱼草Rosea1基因的上游引物为Rosea1-F：5’-GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物为Rosea1-R：5’-CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’；以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应分别扩增金鱼草Delila基因和Rosea1基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19-T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a，连接产物与大肠杆菌DH5a的体积比为1：10，连接产物转入100μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列，序列如下：

金鱼草Rosea1基因：

atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50

agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100

atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150

ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200

gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250

aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300

aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350

acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400

tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450

agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500

tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550

cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600

gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650

aattggaaat taa                                         663

金鱼草Delila基因：

atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa  50

gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct  100

ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc  150

tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa  200

tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg  250

agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct  300

gcattatcac cagaagacct cactgatgct gagtggtttt tcttggtttg  350

catgtctttc atattcaata ttggccaagg gttgcctgga agaacattag  400

cacgaaatca agcagtatgg ctatgcaacg ctcatcgtgc ggacaccaaa  450

gttttctcgc gttctttgct tgcaaagagt gcgtcaattc agacagttgt  500

gtgctttcca tattcagaag gtgtagttga gctgggagca acagagctag  550

taccggagga tttgaatcta atccagcata taaaaacttc attcttggac  600

agtcctgcca ccgttcccaa gattcccaac tatgtctcca acagtattac  650

aaacaacaat gacctcattt gtgaagcgct tgaacatgct aatataccag  700

aaaacgatct tgatcagctt ttgaattgtc cagacacgaa catatgttct  750

cctgataaca gtttggatga ctttgcagac aatttactca tagacgaatc  800

gaatttggca gaaggcatca atggggaggt tcctcaaaca caaagctggc  850

ctttcatgga tgatgcaatc agcaattgtc tcaatagttc tatgaattct  900

agtgactgta tatctcaaac tcatgaaaat ctagagtctt ttgctccact  950

ttctgatgga aaagggccac cggagacgaa taattgtatg cacagcactc  1000

aaaaatgcaa tcagcagata gaaaacacgg gtgtccaagg cgatgaggtc  1050

cattatcaag gggtactttc caatcttttg aagagttccc atcagttggt  1100

tcttggtccc tacttcagaa atgggaatag agaatcaagc ttcgttagtt  1150

ggaacaagga tggatcgtcg ggtactcatg ttccccgaag cggaacctca  1200

caaagatttc tgaagaaagt actttttgaa gtagctagaa tgcatgaaaa  1250

ctccaggctt gatgctggta aacaaaaggg caacagtgac tgccttgcaa  1300

agccaacggc tgatgaaatt gatagaaacc acgtcttgtc agagagaaaa  1350

cgcagagaga aaataaacga acggtttatg attcttgcat ccctagtccc  1400

atccggtggc aaggttgaca aagtatcaat actagaccat acaatagatt  1450

acttgagagg gcttgagagg aaagtcgacg agctggaatc taacaaaatg  1500

gtaaagggcc gggggcggga atcaactaca aaaactaaac tacacgatgc  1550

cattgagagg acctctgata attatggcgc aacaaggaca agtaacgtca  1600

agaaaccgtt gacaaacaag agaaaggctt ctgatacgga caagattgga  1650

gccgtaaata gcagaggtcg attgaaagat tccttaacag ataatataac  1700

tgtgaacatt acaaacaagg atgtgttgat tgtcgtgact tgttcttcca  1750

aggagtttgt attgcttgaa gtgatggaag ccgtaagacg actaagtttg  1800

gattccgaaa ctgttcaatc ttccaacaga gatggaatga tatctattac  1850

cataaaagcc aagtgcaagg gattgaaggt tgcatcagca agtgtgatca  1900

aacaagctct tcagaaagtt actatgaagt cttgaagtt              1939

（2）构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体

用EcoR I和HindIII双酶切植物表达载体pBI121和pCAMBIA-1302，回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测及提取质粒做酶切检测筛选阳性克隆，获得pCAMBIA-1302⁺中间载体；用BamH I和Sac I双酶切含有金鱼草Delila基因的pMD19-T Simple载体和pCAMBIA1302⁺中间载体，回收的酶切产物用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证获得pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒；用BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD 19-T Simple载体和pCAMBIA1302⁺-DEL重组质粒，回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证，得到含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体，该表达载体序列如核苷酸列表<210>3所示；

（3）制备含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株

将含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

（4）制备转基因丹参植株

采用常规组织培养技术方法获得无菌丹参试管苗，根癌农杆菌介导的丹参遗传转化体系采用叶盘法，即将继代培养15天的丹参无菌苗叶片切成小块，转入每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上预培养1天，用含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株浸染预培养过的丹参叶片，浸染方法为28℃恒温100转/分钟浸染25～30分钟，将浸染过的叶片置于每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上暗培养2～3天至叶片边缘有农杆菌长出，将叶片从培养基上取出，转接到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的MS培养基中进行培养，长出抗性芽后将其转入到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株的DNA，波长为302nm的紫外线下可同时观察到663bp和1939bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。