[发明专利]一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸是一种天然的二元羧酸，是三羧酸（Tricarboxylic acid cycle，TCA）循环中的一个中间产物，广泛地存在于动植物和微生物中。琥珀酸作为一种重要额有机合成中间体，其衍生物在食品、医药、香料、农药、染料、油漆和塑料等领域广泛应用，用于生产许多化工产品如己二酸、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、琥珀酸盐，n-甲基吡咯烷酮和2-吡咯烷酮等，因此有着广阔的需求市场。并且随着一些新应用领域的不断拓展，琥珀酸的需求量继续猛增。以可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产的琥珀酸摆脱了对石油化工原料的依赖，是一种绿色平台产品。

能够利用微生物发酵法积累琥珀酸的菌株有很多，目前用于研究微生物法生产琥珀酸的菌株主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）、产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimia succiniciproducens）和大肠杆菌（Escherichia coli）。其中，产琥珀酸厌氧螺菌发酵条件较为苛刻，营养条件复杂，发酵周期较长，无法耐受高浓度的葡萄糖和琥珀酸盐，并且具有潜在的致病性；产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼海姆菌属于瘤胃菌，其生理、代谢和遗传背景并不十分清楚，遗传工具发展也不成熟，且发酵副产物较多。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，作为一种模式生物，其遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究琥珀酸代谢途径和提高琥珀酸产量的理想载体。但是琥珀酸是野生大肠杆菌的一种TCA循环中间产物，产量很低，需要通过基因工程的改造提高其产量。利用大肠杆菌工程菌好氧发酵生产琥珀酸，大肠杆菌工程菌生长相对较快，生物量较大，但是在菌体快速生长繁殖或高密度发酵琥珀酸生产中，往往会出现通气量不足，TCA循环受到抑制，而造成副产物乳酸积累影响琥珀酸的产量。相对好氧发酵，低氧发酵有着培养过程简单、生产规模容易扩大的优点，并且能够减少发酵工业中最大的能量消耗成本----通气搅拌成本。同时低氧发酵也无需像严格厌氧发酵那样需要在氮气保护等辅助手段下进行，因此在生产上更为简单易行，对设备的要求也更低。因此低氧发酵生产琥珀酸相对现在普遍采用的好氧发酵具有明显的优势。

经检索，利用低氧发酵生产琥珀酸的工程菌还未见报道。

发明内容

针对利用大肠杆菌好氧发酵生产琥珀酸过程中存在的上述缺陷，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用。

本发明通过基因工程技术，利用基因敲除技术构建了一株用于低氧发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株，所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05,菌株的基因型为MG1655 ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhA，该菌已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291。

上述大肠杆菌（Escherichia coli）QMJ05，属于革兰氏阴性菌。该菌呈杆状，大小为0.4~0.6微米×1~3微米，有普通菌毛和性菌毛，无芽孢，生长温度范围在15~46℃之间，最适生长温度为37℃。

上述大肠杆菌工程菌株的出发菌株是大肠杆菌K-12系列MG1655。

上述大肠杆菌工程菌株的构建及检测步骤是：

(1).ptsG基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655中敲除基因ptsG（磷酸转移酶系统II）。所得缺失ptsG基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG)。

(2).poxB基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG)中敲除基因poxB（丙酮酸氧化酶）。所得缺失poxB基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)。

(3).pta基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)中敲除基因pta（磷酸转乙酰基酶）。所得缺失pta基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)。

（4）iclR基因的敲除