[发明专利]菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵法生产蛋白质的领域，具体涉及一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的微生物制备方法。

技术背景

藻胆蛋白原产自海洋，主要从蓝藻与红藻类中提取而来。藻胆蛋白是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分，根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻胆蛋白是是具有特殊生物性能的蛋白质。藻胆蛋白具有促进生物血细胞再生，全面增强机体的防病抗病能力，能抑制癌细胞生长，是一种无毒副作用的理想光敏剂，可减轻肿瘤化疗的副作用。此外，藻胆蛋白还具有抗氧化和抗炎作用。藻胆蛋白作为一种天然色素，也可作为高级天然色素应用于食品和化妆品中。藻胆蛋白由于还具有强烈的荧光性，在分子生物学上可用于制备荧光探针，适用于免疫学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的研究与应用。

天然藻胆蛋白，不仅制备成本高昂、工艺复杂，且得到的是色素蛋白复合物，效果不稳定，难以建立规范统一的质量标准，要想深入研究其生物活性和开发藻胆蛋白成单体药物需要解决微藻培养、采收以及藻胆蛋白提取、纯化等一系列成本高昂的长周期工艺。因此，通过藻类得到藻胆蛋白用于药物开发几乎是不可能的。Bryant等1985年使聚球藻Synechococcus PCC 7002的藻蓝蛋白基因和Cyanophora paradoxa的别藻蓝蛋白基因在大肠杆菌中成功表达，这标志着运用基因工程技术，开展藻胆蛋白异源表达的开始。且临床研究表明，重组别藻蓝蛋白无毒副作用，具有抗氧化和免疫调节作用，以此实现其抗肿瘤功能。稳定、良好的抗肿瘤活性和低廉的生产成本使其有望开发成为基因工程新药。

由于微生物易于批量培养，利用大肠杆菌、酵母等成熟的表达系统发酵生产重组别藻蓝蛋白具有极大地应用潜力。目前发酵法生产重组别藻蓝蛋白的主要碳源为葡萄糖。相比葡萄糖，菊粉具有广泛的来源。菊粉是从菊芋中提取而来的，菊芋耐旱、耐旱，对环境适应性强，自我繁殖力强，且生长过程中不需精细管理；种植菊芋不占用耕地，可充分利用荒地、坡地、盐碱地，且产量极高，目前，在中国青海、山东、新疆、黑龙江、江苏、四川、宁夏等省份都有大面积种植，所以菊粉成本低廉易得。同比葡萄糖为碳源，利用廉价的天然原料菊粉为原料，可以大大降低生产成本，易于工业化生产，进而满足食品、医药等各行业对重组别藻蓝蛋白的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的微生物制备方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，将菊粉作为原料经降解作为种子液，再将大肠杆菌P2在发酵培养基的作用下经摇床或发酵罐培养，最后经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，即得到菊粉源重组别藻蓝蛋白。

1）将大肠杆菌P2按体积比15-20%接种于种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；而后将培养液按体积比1-5%（v／v）接种于二级种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；

2）将上述培养液按1-5%（v／v）的接种量接种，于发酵培养基中以35-39℃，罐压0.5Kg/cm²，pH7.0-7.5，搅拌转速为200-400rpm，空气流量5-15L/min，在发酵至溶氧反弹时补入补料培养基，35-39℃，摇床培养至对数生长后期，于培养基中加入诱导剂，降温至25-30℃，再培养10-15h；

3）发酵结束后破碎细胞，对细胞破碎物进行分离纯化，得目的蛋白。

所述步骤1）培养大肠杆菌P2的培养基为：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl 5-15g，自来水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；

二级种子液培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，自来水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。

所述步骤2）发酵培养基为蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl3-10g，MgSO₄3-10g，菊粉酸解液（其中的还原糖浓度约为50gL）100-500ml，自来水补足1L的体积，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；补料培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO₄3-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。