[发明专利]菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：将菊粉作为原料经降解作为种子液，再将大肠杆菌P2在发酵培养基的作用下经摇床或发酵罐培养，最后经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，即得到菊粉源重组别藻蓝蛋白。

2.按权利要求1所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：

1）将大肠杆菌P2按体积比15-20%接种于种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；而后将培养液按体积比1-5%（v／v）接种于二级种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；

2）将上述培养液按1-5%（v／v）的接种量接种，于发酵培养基中以35-39℃，罐压0.5Kg/cm²，pH7.0-7.5，搅拌转速为200-400rpm，空气流量5-15L/min，在发酵至溶氧反弹时补入补料培养基，35-39℃，摇床培养至对数生长后期，于培养基中加入诱导剂，降温至25-30℃，再培养10-15h；

3）发酵结束后破碎细胞，对细胞破碎物进行分离纯化，得目的蛋白。

3.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1）培养大肠杆菌P2的培养基为：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl 5-15g，自来水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；二级种子液培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，自来水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。

4.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤2）发酵培养基为蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO₄3-10g，菊粉酸解液（其中的还原糖浓度约为50g／L）100-500ml，自来水补足1L的体积，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；补料培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO₄3-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。

5.按权利要求4所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述菊粉酸解液中的还原糖浓度约为50g／L。

6.按权利要求5所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述菊粉酸解液为将菊粉与1.0-2.0%（w／w）的硫酸溶液按比例1:8（w／v）混合，混合后于90℃水浴30-50min,然后用5mol／L的NaOH溶液将其pH调节至6.5-7.5。

7.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述诱导剂为0.3mol／L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导时加诱导剂至其发酵液中终浓度为0.3mmol／L。

8.按权利要求1所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌P2为能生产活性重组别藻蓝蛋白的大肠杆菌，该菌株是由大肠杆菌菌株P1，通过分子生物学手段敲除其中的氨苄霉素抗性基因，在原位点插入卡那霉素抗性基因而得到。