[发明专利]抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用

权利要求书

1.一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板，其特征在于：为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火杂交形成的双链DNA。

2.一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：包括骨架载体、猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子和权利要求1所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

3.根据权利要求2所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：

所述的骨架载体为pEGFP-C1载体；所述的pEGFP-C1载体的多克隆位点中的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点进行了突变；

所述的猪U6RNA聚合酶Ⅲ启动子取代了pEGFP-C1载体的f1复制起点，在猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子后接入了权利要求1所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

4.根据权利要求3所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：所述的BamH Ⅰ酶切位点由AAGCTT突变为AAGTTT，所述的HindⅢ酶切位点由GGATCC突变为GGAACC。

5.权利要求4所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）突变pEGFP-C1载体多克隆位点中的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH；

（2）PCR扩增得到如SEQ ID NO.4所示的Mlu Ⅰ酶切位点+TAT+Spe Ⅰ酶切位点+SV40复制起点序列+Stu Ⅰ酶切位点的DNA片段S；

（3）将步骤（2）得到的片段S和步骤（1）得到的重组载体pEGFP-C1-BH分别用Mlu Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-Spe Ⅰ；

（4）PCR扩增得到如SEQ ID NO.5所示的Spe Ⅰ酶切位点+猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子序列+BamH Ⅰ酶切位点+ATA+Hind Ⅲ酶切位点+Mlu Ⅰ酶切位点的DNA片段U6；

（5）将步骤（4）得到的片段U6和步骤（3）得到的重组载体pEGFP-C1-SpeⅠ分别用Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-U6；

（6）将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火杂交得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板；

（7）将步骤（5）得到的重组载体pEGFP-C1-U6用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，酶切后的片段与步骤（6）得到的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板连接得到抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。

6.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的突变的方法为：

①以pEGFP-C1载体上1386-1646bp片段为靶片段，设计B1和B2引物突变掉BamH Ⅰ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段B；

B1：5’-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3’，

B2：5’-ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’；

②将①中得到的靶片段B和pEGFP-C1载体分别用Sma Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-B；

③以pEGFP-C1载体上606-1357bp片段为靶片段，设计H1和H2引物突变掉HindⅢ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段H；

H1：5’-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3’，

H2：5’-GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3’；

④将③中得到的靶片段H和②中得到的重组载体pEGFP-C1-B分别用Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH。