[发明专利]抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNA干扰载体，特别涉及一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用。

背景技术

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase Ⅲ类降解（e.g.Dicer,E.coli,RNase Ⅲ）、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs，以及PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。其中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达，该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶Ⅲ的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果，具有表达稳定、持久，抑制效果明显的特点。

通过质粒表达siRNAs大都是用Pol Ⅲ启动子启动编码shRNA（short hairpin RNA）的序列。选用Pol Ⅲ启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol Ⅲ启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。而且，由于质粒可以复制扩增，与其它合成方法相比，能够显著降低制备siRNA的成本。此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

本发明的另一目的在于提供一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。

本发明的再一目的在于提供上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法。

本发明的目的还在于提供上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

通过大量筛选和实验得到干扰猪源p53基因的有效靶片段，其序列为：

5’-GTTGGGAGAATTTATGAAA-3’。

根据上述靶片段序列设计shRNA的转录模板的正义链和反义链，loop结构的序列为TTCAAGAGA，转录终止序列采用6个T结构。为了便于插入载体，在正义链的5’端添加了BamH Ⅰ酶切位点粘性末端GATCC，3’端添加了HindⅢ酶切位点粘性末端A；反义链的5’端添加了HindⅢ酶切位点粘性末端AGCTT，3’端添加了BamH Ⅰ酶切位点粘性末端G。最终得到干扰猪源p53基因的shRNA的正义链，如SEQ ID NO.2所示，干扰猪源p53基因的shRNA的反义链，如SEQ ID NO.3所示。

一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火杂交形成的双链DNA。