[发明专利]一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid，LA)，又称2-羟基丙酸(2-Hydroxy propionic acid)、α-羟基丙酸、丙醇酸，是无氧条件下糖酵解的最终产物，由乳酸脱氢酶作用于丙酮酸和NADH而生成。

乳酸是世界三大有机酸之一(其它两个为乙酸和丙酮酸)，其用途极为广泛。在食品、医药、化妆品、化工等领域都有运用。乳酸的一些衍生物如乳酸酯和乳酸盐等也经常在不同的行业中被用到。光学纯度在97%以上的D-乳酸即可被视为高光学纯度的D-乳酸，它是多个手性物质的前体，是一个重要的有机合成原料。在农药领域中被用于合成高效低毒的杀虫剂和除草剂，医药和化妆品上也用D-乳酸来合成某些手性物质，具有良好的经济和社会价值。

乳酸的工业化生产已有100多年的历史了，自从1886年德国学者Leichmann分离得到德氏乳杆菌(Ltobacillusdetbruckii)后，极大的推动了乳酸的工业生产由化学合成法向微生物发酵法的转变。德氏乳杆菌是一株极为优秀的乳酸菌，它可以在50℃下将麦芽汁发酵转化为乳酸。实际上由发酵法得到的乳酸种类主要是由菌种决定的，因菌种不同，发酵后可获得L-乳酸、D-乳酸或消旋体乳酸。L-乳酸的研究步伐开始的较早，目前发酵生产L-乳酸的工艺条件已研究的十分清楚。与L-乳酸相比，D-乳酸除旋光性不同之外其它理化性质都和L-乳酸没有明显差别。因此，现在工业上D-乳酸的生产主要是借鉴L-乳酸已成熟的工艺，其关键则是在于筛选培育高纯度D-乳酸生产菌种。

因此，本领域有必要培育高纯度D-乳酸生产菌种，以应用于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种应用重组粘质沙雷氏菌生产D-乳酸的方法，包括：

(1)提供重组粘质沙雷氏菌，该菌株中乙酰乳酸合成酶不表达(包括低表达)；

(2)培养(1)的重组粘质沙雷氏菌，从而生产D-乳酸。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。

在另一优选例中，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备：

(1)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列；

(2)将(1)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；

(3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。

在另一优选例中，所述的同源交换方法是：将α-乙酰乳酸合成酶基因全长1686bp，将位于该基因43bp-534bp之间的片段克隆到pUTKm上，该质粒转入到粘质沙雷氏菌中之后，上面的α-乙酰乳酸合成酶基因片段会与粘质沙雷氏菌基因组上的α-乙酰乳酸合成酶基因的同源部分发生交换，从而截断该基因，不能正常表达有活性的酶，从而粘质沙雷氏菌失去了合成2,3-丁二醇的能力。

在另一优选例中，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤：

将步骤(1)的重组粘质沙雷氏菌进行驯化培养。

在另一优选例中，所述的驯化培养方法如下：将重组粘质沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的液体培养基(较佳地为LB培养基)中，在起始pH值6.0±0.5、28±2℃、200±50rpm摇床上培养12±3小时；

将经过前述培养的菌液涂布到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的固体培养基(较佳地为LB培养基)上，在37±1℃下培养24～36小时(较佳地12～15小时)，选择平板上体积较大的单个菌落。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的培养重组粘质沙雷氏菌包括：

(a)在有氧、28±2℃(较佳地，28±1℃)、pH值为7.0±0.3(较佳地，7.0±0.2)的条件下培养重组粘质沙雷氏菌，至菌体浓度OD₆₀₀值达到25-40(较佳地，28-35)；

(b)向发酵培养基中添加葡萄糖使之终浓度为100±20g/L(较佳地，100±10g/L)，在无氧、44±2℃(较佳地，44±1℃)、pH值为6.0±0.3(较佳地，6.0±0.2)的条件下，继续培养36-60小时(较佳地，42-54小时)。