[发明专利]一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产D-乳酸的方法

权利要求书

1.一种应用重组粘质沙雷氏菌生产D-乳酸的方法，其特征在于，包括：

(1)提供重组粘质沙雷氏菌，该菌株中乙酰乳酸合成酶不表达；

(2)培养(1)的重组粘质沙雷氏菌，从而生产D-乳酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备：

(1)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列；

(2)将(1)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；

(3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤：

将步骤(1)的重组粘质沙雷氏菌进行驯化培养。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的驯化培养方法如下：将重组粘质沙雷氏菌加入到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的液体培养基中，在起始pH值6.0±0.5、28±2℃、200±50rpm摇床上培养12±3小时；

将经过前述培养的菌液涂布到含50±10g/L葡萄糖和50±10g/L乳酸钠的固体培养基上，在37±1℃下培养24～36小时(较佳地12～15小时)，选择平板上体积较大的单个菌落。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的培养重组粘质沙雷氏菌包括：

(a)在有氧、28±2℃、pH值为7.0±0.3的条件下培养重组粘质沙雷氏菌，至菌体浓度OD₆₀₀值达到25-40；

(b)向发酵培养基中添加葡萄糖使之终浓度为100±20g/L，在无氧、44±2℃、pH值为6.0±0.3的条件下，继续培养36-60小时。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，在转速700±200rpm，通气量200±40vvm下培养；

步骤(b)中，在转速300±100rpm下培养。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，发酵培养基成分为：葡萄糖60±10g/L，酵母粉20±4g/L，NaCl 5±1g/L，KH₂PO₄ 5±1g/L，MgSO₄ 0.5±0.1g/L，MnSO₄ 0.05±0.01g/L。

9.一种重组粘质沙雷氏菌，该菌株的基因组中所述的重组粘质沙雷氏菌的基因组中，含有突变的乙酰乳酸合成酶基因序列，其不编码乙酰乳酸合成酶。

10.如权利要求9所述的重组粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述的重组粘质沙雷氏菌如下制备：

(1)提供一打靶质粒，所述的打靶质粒中，含有乙酰乳酸合成酶基因第43bp-534位序列；

(2)将(1)所述的打靶质粒转入粘质沙雷氏菌内，通过同源交换使得粘质沙雷氏菌基因组上的乙酰乳酸合成酶基因失活；

(3)选择发生了同源交换的粘质沙雷氏菌，获得重组粘质沙雷氏菌。