[发明专利]定性检测KRAS基因分型的测序引物对及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者组织DNA中KRAS基因型，具体涉及一种定性检测KRAS基因分型的测序引物对及其试剂盒。

背景技术

RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS，KRAS和NRAS，其中KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；异常时该基因永久活化，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭，使细胞增殖失控而癌变（见图1）。据统计，KRAS突变型结直肠癌患者约占30-40%，在肺癌患者中突变率约占20-30%。

NCCN专家组认为，KRAS突变是结直肠癌形成过程中的早期事件，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致，可用于早期诊断和复发的及时监测。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解结直肠癌等恶性肿瘤的发展预后、评估放化疗疗效的重要指标：

为结直肠癌等恶性肿瘤的早期诊断提供依据：科学研究发现，人体内从单个细胞开始到形成米粒大小的肿瘤，需要8～10年，在此阶段人体几乎没有任何症状；从米粒大小的肿瘤发展成杏仁大小的肿瘤，只需1年左右；如果没有及时发现，杏仁大小的肿瘤发展到晚期只需要2～6个月。

近几年西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药物（表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂）联合化疗的应用为广大结直肠癌患者带来福音。KRAS基因检测已被写入最新版《美国国立癌症综合网络（NCCN）结直肠癌临床实践指南》。新指南传递出了两条重要的信息：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗治疗（见图1）。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯进行分子靶向治疗。

为癌症患者的预后提供指导。例如Ryan et al(2003)发表在顶尖杂志GUT（IF>10）的文章指出，术后血清KRAS基因突变检测对于肿瘤的预后具有重要作用：术后血清KRAS基因突变检测阳性者复发率高达63%，而术后血清KRAS基因突变检测阴性者的复发率仅为2%。

a．EGFR被TGFα、EGF等配体激活后启动细胞内信号传导，维持细胞存活，促进细胞增殖、转移，在存在血管内皮生长因子(VEGF)的条件下还可促进新生血管生成。

b．肿瘤的靶向治疗药物如抗EGFR单抗（西妥昔单抗、帕尼单抗等）通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增殖、转移以及新生血管生成。

c．KRAS基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性。

目前医院用于KRAS基因检测的“金标准”是PCR-直接测序法,但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。

焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的。

目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行KRAS的基因多态性检测的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性高、成本低、定量、准确检测KRAS的基因突变的测序引物对及其试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测KRAS基因分型的测序引物对，所述引物对为如下引物：

KRAS1213正向扩增引物：5′-TATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′（SEQ ID NO.1）；

KRAS1213反向扩增引物：5′-TATTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3′（SEQ ID NO.2）

KRAS1213测序引物：5′-GCACTCTTGCCTACG-3′（SEQ ID NO:3）