[发明专利]组织原位高表达ILK蛋白载体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言涉及外源性基因的组织原位表达，及利用外源基因的表达起到治疗慢性心力衰竭疾病的作用，特别涉及组织原位高表达ILK蛋白载体的制备方法及其应用。

背景技术

慢性心力衰竭主要以心肌细胞丢失，残留心肌细胞的功能恶化、心肌肥厚与血管新生的不协调为特征。而治疗慢性心力衰竭疾病一直是现在医疗中一个比较棘手的问题，它的治疗主要涉及到缓解症状、抑制心脏重构、改善长期预后等方面。然而目前我国有症状心衰病人的生存率很低，预后比大多数进展期恶性肿瘤还差，随着人口老龄化进程的加快和高血压、冠心病等常见心血管病发病率的上升，其患病率仍在不断上升。

整合素连接激酶(ILK)是一有功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能自我磷酸化，并磷酸化许多外源底物，如髓鞘碱性蛋白、整合素β1胞浆区、蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)。心脏中的ILK主要集中在肋状体(costamere)和Z板。肋状体是心肌肌纤维膜和心脏横纹肌Z板相连的区域，它由细胞骨架蛋白和信号激酶的复杂蛋白网络组成，可以连接胞内收缩装置和胞外环境，感受机械牵拉刺激并转导下游信号。研究表明，ILK通过N末端锚蛋白重复序列与PINCH蛋白结合，通过激酶区与β整合素胞浆区以及parvin蛋白结合，从而形成ILK-PINCH-parvin复合体，这一复合体是粘着斑复合体(FAK)的关键成分，在心脏机械感应、机械传导和维持心脏功能方面起着极为重要的作用。在脊椎动物的研究中，Bendig等发现斑马鱼的ILK基因纯合错义突变将导致心脏收缩能力的进行性降低和牵拉一应答基因ANF、VEGF的严重下调，引起斑马鱼在胚胎期即发生心衰。在哺乳动物中，White等证实小鼠ILK对正常心功能是必需的：ILK缺失的纯合子小鼠死于围着床期；特异性消除心脏ILK基因将导致小鼠在出生后数周内发生自发性扩张型心肌病，左心室普遍扩大伴纤维化。因此，作为ILK-PINCH-parvin复合体的枢纽，ILK在维持心脏结构和功能方面起着举足轻重的作用。

在本发明之前，治疗慢性心力衰竭疾病的药物主要包括有：利尿剂、洋地黄等缓解症状的药物以及β受体阻滞剂、ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂等改善预后类药物；近些年，植入CRT进行心脏再同步化治疗也在一小部分心力衰竭患者中开始运用。目前，药物治疗疗效有限，很多患者尽管给予了最佳的药物治疗，仍然不可避免地进展到终末期心力衰竭；而CRT治疗极为昂贵，且只对左右心室收缩不同步的患者有效，对大部分心室收缩同步的心力衰竭患者无效。

综上所述，尽管已有多类药物被应用来治疗慢性心力衰竭，但总体治疗效果仍然有限，因此，心衰治疗领域迫切需要开发出新的治疗药物和方法。

发明内容

本发明的一个目的就在于克服上述缺陷，提供一种组织原位高表达ILK蛋白载体。

本发明的技术方案是：

组织原位高表达ILK蛋白载体，其主要技术特征在于所述表达载体包含编码人类ILK蛋白的基因。

其中所述的编码人类ILK蛋白的基因在人类染色体上具体位置为位于Chromosome：11；NC_000011.9，该基因具体的核苷酸序列在人类基因组数据库(NCBI和Ensebl genomic)中其基因名称为：ILK，该基因在NCBI基因库中的ID号为：3611；在Ensebl基因库中的ID号为：ENSG00000166333。

其中NCBI基因库ID号为：3611的基因序列在本发明中以SEQ ID No.1表示；Ensebl基因库中ID号为：ENSG00000166333的基因序列在本发明中以SEQ IDNo.2表示。该两段基因序列均能表达人类ILK蛋白(含452个氨基酸)，所表达的ILK蛋白其结构和功能均无差别。

本发明的另一技术方案是：

组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其主要技术特征在于组织原位高表达ILK蛋白载体采用血管内注射制剂、皮下注射制剂以及病灶器官局部组织注射制剂。

其中所述的生物病毒(virus)载体系统选自腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒载体系统，优选腺病毒载体系统。上述病毒载体系统均可通过商业购买获得。例如本发明中优选的腺病毒载体系统可以选用求必精生物化学公司(Qbiogene.inc)的AdEasy^TM。

本发明还有一技术方案是：

组织原位高表达ILK蛋白载体制备方法，其主要技术步骤在于：