[发明专利]组织原位高表达ILK蛋白载体的制备方法及其应用

权利要求书

1.组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述表达载体包含编码人类ILK蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述编码人类ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于所述编码人类ILK蛋白的基因序列具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其特征在于组织原位高表达ILK蛋白载体采用血管内注射制剂、皮下注射制剂以及病灶器官局部组织注射制剂。

5.根据权利要求4所述的组织原位高表达ILK蛋白载体的应用，其特征在于血管注射的制剂最优选是冠状动脉注射制剂。

6.根据权利要求1所述的组织原位高表达ILK蛋白载体，其特征在于作为治疗心力衰竭的药物的应用。

7.根据权利要求1所述的组织原位高表达ILK蛋白载体制备方法，其步骤在于：

(1)通过人cDNA文库扩增野生型ILK cDNA，并在ILK cDNA上下游引物分别引入ScaI和XhoI位点以亚克隆至pShuttle，形成穿梭质粒pShuttle-ILK，PCR产物经DNA测序确认；

(2)挑选1.0g阳性重组质粒pShuttle-ILK，经PmeI线性化后转化入含pAdEasy-1高效感受态大肠杆菌BJ5183，在含卡那霉素LB琼脂培养基中37℃孵育过夜；

(3)经同源重组，BJ5183内产生重组的AdEasy质粒；

(4)同源重组质粒pAd-ILK确认：挑选部分克隆置于3-5ml含卡那霉素的LB培养基中37℃，225-250rpm振荡培养过夜，小量提取pAd-ILK。pAd-ILK的鉴定采用PacI酶切法，pAd-ILK经PacI酶切后0.8％琼脂糖-TAE胶电泳；

(5)将7×10⁶HEK293A细胞铺于100mm培养皿，转染时细胞汇合率达80％；

(6)先用OptiMEM培养基冲洗一次细胞，每个培养皿内加入5ml OptiMEM培养基；

(7)取15μg重组质粒pAd-ILK，经PacI酶切线性化后转染入HEK293A细胞，转染试剂采用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；

(8)通过观察转染细胞的细胞病理效应了解感染进程，在转染7-10天后收集细胞，经干冰反复冻融3次获得Ad-ILK病毒保存液；

(9)空载腺病毒Ad-null用相似方法，通过空载穿梭质粒pShuttle-CMV与pAdeasy-1重组制备，得组织原位高表达ILK蛋白载体。