[发明专利]快速检测和鉴定生物物体的方法

说明书

本申请是国际申请日为2002年3月4日的国际申请PCT/US2002/006763进入中国、申请号为02809122.1的题为“快速检测和鉴定生物物体的方法”的发明专利申请的分案申请。

政府支持的声明

本发明得到美国政府DARPA/SPO合同BAA00-09的支持。美国政府可在发明中拥有一定权利。

技术领域

本发明涉及快速检测和鉴定环境、临床或其它样品中的生物体的方法。该方法提供了检测和特征分析任何生物体，包括细菌和病毒的独特碱基组合签名(BCS)。这种独特的BCS可用于快速鉴定该生物体。

背景技术

快速和明确的微生物鉴定对各种工业、医学、环境、质量和研究原因是需要的。传统上，微生物学实验室的功能是通过直接检查和培养样品来鉴定传染性疾病的病原体。自从1980年代中期以来研究者们反复证明了分子生物学技术在实践上的用途，许多这些技术形成了临床诊断试验的基础。这些技术中的一些包括核酸杂交分析、限制性酶分析、遗传序列分析和核酸的分离及纯化(参见，如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。这些方法一般费时且冗长。另一选择是聚合酶链式反应(PCR)，或其它扩增方法，根据所用侧翼引物扩增特异性靶DNA序列。最后，检测和数据分析可将杂交转换成分析结果。

其它检测生物体的技术包括高分辨率质谱(MS)、低分辨率MS、荧光、放射性碘化、DNA芯片和抗体技术。这些技术中没有一个是完全令人满意的。

质谱提供了被分析分子的详细信息，包括很高的质量准确性。它也是一种可容易地自动化的方法。然而，高分辨率MS单独不能用来对未知的或生物工程改造的生物体进行分析，或运用于存在高背景水平生物体(“混乱的”背景)的环境中。低分辨率MS不能检测某些已知的生物体，如果它们的光谱线足够弱或足够接近样品中其它活生物体的光谱线。具有特异性探针的DNA芯片只能够测定具体的预计的生物体的存在与否。因为有几十万种良性细菌，一些细菌在序列上十分类似于有威肋的细菌，即使有10,000个探针的芯片陈列仍缺乏检测具体生物体所需的宽度。

抗体面对的多样性限制比陈列更严峻。如果抗体设计是针对高度保守的靶子以提高多样性，假报警问题就会是主要问题，还是因为危险生物体十分类似于良性生物体。抗体只能检测相对不混乱环境中的已知生物体。

一些研究中组报道了用高分辨率电喷射离子化-傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(ESI-FT-ICR MS)检测PCR产物。准确测定确切的质量与至少一种核苷的数量的知识相结合，可计算出大约100个碱基对的PCR双链体产物的总碱基组成。(Aaserud等.，J.Am.Soc.Mass Spec.7：1266-1269，1966；Muddiman等.，Anal.Chem.69：1543-1549，1997；Wunschel等.，Anal.Chem.70：1203-1207，1998；Muddiman等.，Rev.Anal.Chem.17：1-68，1998)。电喷射离子化-傅立叶变换-离子回旋共振(ESI-FT-ICR)MS可通过平均分子质量来确定500碱基对双链体，PCR产物的质量(Hurst等.，Rapid Commun.Mass.Spec.10：377-382，1996)。已报道了采用基质-辅助的激光解吸离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱来特征鉴定PCR产物。(Muddiman等.，Rapid Commun.Mass.Spec.13：1201-1204，1999)。然而，用MALDI只能观察75个核苷以上的DNA的降解限制了此方法的应用。

美国专利5,849,492描述了挽回系统发育信息DNA序列的方法，包括搜索两个高度保守片断包围的基因组DNA的高度趋异区段，设计了用PCR扩增此高度趋异区域的通用引物，用此通用引物经PCR技术扩增该基因组DNA，然后测是比基因序列以确定该生物体的身份。

美国专利5,965,363公开了用质谱技术分析扩增的靶核酸来筛检核酸多态性的方法，和提高这些方法的质量分辨率及质量准确性的方法。