[发明专利]嗜肺军团菌检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体是一种实时荧光PCR熔解曲线检测嗜肺军团菌的试剂盒。

背景技术

军团菌是一种兼性胞内寄生菌，是引起人类军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有爆发流行，我国已将其列入14种新发传染病之一。据国外报道，院内不明原因肺炎感染有10％是由军团菌引起。目前已知军团菌虽有52个种，70多个血清型。但临床上80%以上军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。因此，嗜肺军团菌的鉴定对于军团菌病诊断具有重大价值。

目前军团菌的检测鉴定方法主要有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测、分子检测技术等。但以上的检测方法均存在不足，如直接分离培养，所需时间长达3～10天，且阳性率低；尿抗原检测仅对嗜肺军团菌1型具有特异性；分子技术也存在各自的缺点，如传统的聚合酶链反应（PCR）检测操作繁琐、耗时长、易污染；基于荧光共振能量转移原理的杂交探针标记技术价格昂贵、操作复杂；DNA测序是最为准确的军团菌种鉴定方法，但耗时较长，分析困难，不能适应临床上的快速要求，其他分子检测方法均存在各种不足。基于这些检测方法建立的试剂盒，均也存在以上的各种不足。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR具有快速、准确、灵敏、特异等优点，自发明以来在微生物检测研究中得到广泛应用。

发明内容

该检测嗜肺军团菌的试剂盒具有简便、快速、敏感性和特异性高，且成本低廉、可直接用于临床标本及环境水样本检测。

本发明是这样实现的：一种嗜肺军团菌核测试剂盒，基于荧光共振能量转移原理，选取一种猝灭荧光基团，采用由上游引物、下游引物组成的一对引物及由锚定探针、猝灭探针组成的一对标记探针，建立新型的实时荧光PCR熔解曲线法对嗜肺军团菌进行检测；

所述上游引物为5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，

所述下游引物为5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’，

所述锚定探针为5'-CCCATACTCGAGTCAACC(FAM)-3’，

所述猝灭探针为5'-(BHQ1)TATTATCTGACCGTCCCAG(ph)-3’。

嗜肺军团菌检测试剂盒，是基于实时荧光PCR方法建立的试剂盒，其组分为DNA提取液、荧光PCR缓冲液、阴性对照及阳性对照，其中，DNA提取液的成分包括5%Chelex-100溶液、10mM三羟甲基氨甲烷盐酸盐、0.1mM乙二胺四乙酸二钠、0.1%叠氮钠、200μg/ml蛋白酶K，荧光PCR缓冲液包括上游引物0.1～0.3μM、下游引物1～3μM、锚定探针0.3～0.5μM、猝灭探针0.1～0.3μM、三羟甲基氨甲烷盐酸20mM、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸0.3～0.6mM、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷0.3～0.6mM、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸0.3～0.6mM、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸0.3～mM、氯化镁3～6mM、热启动酶1～5U，阴性对照0.5ml，为1×10⁴个菌/ml的大肠杆菌培养物，阳性对照0.5ml，为1×10⁴个菌/ml的嗜肺军团菌培养物。（此处中的mM为毫摩尔每升;μM为微摩尔每升，下同）

嗜肺军团菌检测试剂盒，检测结果判定时，熔解曲线分析程序为95℃1min和40℃2min，以1℃/5s的速度，从40℃升温至85℃；嗜肺军团菌的Tm值均为57℃，其它非嗜肺军团菌及非军团菌均无57℃的Tm值。

本发明提供一种检测嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于所描述的时荧光PCR熔解曲线法根据嗜肺军团菌16srRNA基因保守序列设计引物和探针，选取一种猝灭荧光基团代替原有的杂交探针荧光标记物，建立新型的嗜肺军团菌检测试剂盒。该检测嗜肺军团菌的试剂盒具有简便、快速、敏感性和特异性高，且成本低廉、可直接用于临床标本及环境水样本检测。

本发明描述的嗜肺军团菌新检测试剂盒，其主要特点如下：

（1）高特异性：本发明通过对16株嗜肺军团菌（包括15个血清型）、35株非嗜肺军团菌及12株其它非军团菌进行基因分型检测，该试剂盒能准确的鉴定出嗜肺军团菌，说明该检测试剂盒特异性很高；

（2）高敏感性和稳定性：本发明建立的熔解曲线分析法检测嗜肺军团菌试剂盒，其最低检测限度达到100fg/μl，且结果稳定可靠；

（3）检测试剂盒操作简便快速；

（4）检测范围广：作为一种嗜肺军团菌快速检测试剂盒，本发明可以广泛应用于临床及环境水样本中嗜肺军团菌的快速鉴定。

具体实施方式