[发明专利]一种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物学方法，特别涉及一种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法。

背景技术

一直以来，微生物来源的天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重要作用。近20多年来，随着传统抗生素的广泛使用，病原菌的耐药性迅速增加，而从传统的土壤微生物中发现结构新颖的活性化合物却出现了明显的下降趋势，在探索具有生物活性天然产物新来源的过程中，海洋微生物引起了广泛的关注。海洋微生物与传统制药业主要前体来源的陆生微生物具有显著不同的生长环境，能通过新颖的代谢方式来适应恶劣的生存环境，从而可能产生异于陆生微生物的新的次级代谢产物，并且海洋微生物资源丰富。因此我们可以从海洋微生物发酵提取物中寻找新的抗病原菌的药物。由于海洋微生物资源丰富，进行筛选时比较困难，采用传统筛选方法费时而且低效。

黑曲霉可引起植物方面的疾病，使植物发生霉变，进一步造成农业方面的损失，例如：黑曲霉感染可导致洋葱的霉变，当条件有利于其生长，黑曲霉的感染会遍及全部，同时会引起一个普遍的采后的灾害，可以观察到黑曲霉的孢子存在于洋葱的鳞片之间。不仅是洋葱，黑曲霉同时也能引起花生和葡萄的采后灾害等。

另一方面，黑曲霉也可引起人类和动物方面的疾病， 相比于其他曲霉菌，黑曲霉不太可能引起人体和动物方面的疾病，但如果吸入大量孢子，可能发生了严重的肺病。黑曲霉是耳霉菌症的最常见的原因之一（真菌的耳部感染），这可能会导致疼痛，临时听力的损失，并在严重的情况下，损伤耳道和鼓膜。

因此，目前需要一种从资源丰富的海洋微生物发酵提取物中快速筛选新的抗黑曲霉的药物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从海洋微生物的发酵提取物中快速筛选新的抗黑曲霉的药物的方法。

为实现上述目的，提供以下具体技术方案：

一种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法，包括如下步骤：

将待筛选样品，刃天青，黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37℃恒温培养箱中培养一定时间，其中设置阴性对照和阳性对照；优选培养12－36h；

得到结果；即得到微孔板的颜色，酶标仪测量荧光值，和抑制率

根据结果筛选。筛选微孔板的颜色为蓝色或紫色，酶标仪测量荧光值低于15000，抑制率为40%以上。其中所述酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处的荧光值。

所述抑制率的计算公式为：

抑制率%=100%-（实验孔荧光值-阳性对照荧光值）/（阴性对照荧光值-阳性对照荧光值）*100%。

阴性对照为无菌水代替待筛选样品；阳性对照为176ulRPMI-1640培养基代替黑曲霉孢子菌悬液。

具体为：将4 微升待筛选样品，20微升200ug/ml刃天青和176微升2.5×10⁴spores/ml黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37℃恒温培养箱中培养24h；

24h后观察微孔板的颜色变化，并用酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处的荧光值，然后在由荧光值计数出抑制率；取颜色为蓝色或紫色、荧光值低于15000，抑制率为40%以上的微孔，并显微镜观察。

所述的待筛选样品为海洋微生物发酵液提取物。

本发明的检测原理是： 活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色 )转化为荧光物质试卤灵 (粉红红色) ,产生荧光信号。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质二氢试卤灵(白色 ), 使荧光信号下降,无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青使刃天青产生颜色变化,也就不能产生荧光信号,所以该法能通过颜色和荧光信号两方面的变化来特异性检测活性细胞。

本发明提供了从海洋微生物发酵液提取物中快速筛选或检测抗黑曲霉活性物质的方法，关键步骤为：（1）制备海洋微生物发酵液；（2）从发酵液中提取，分离和纯化组分；（3）将每种待测组分，刃天青溶液和黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中；（4）在黑曲霉的培养条件下培养24h；（5）根据刃天青的颜色、在激发波长为550nm发射波长为590nm荧光值以及有荧光值计数出抑制率判断组分对黑曲霉的抑制作用大小；（6）在显微镜下观察由刃天青得出对黑曲霉有抑制作用的组分，由此判断组分抑制黑曲霉的哪个阶段。

本发明实施例提供了3株海洋微生物发酵液提取物分离的87个馏分中筛选出6个馏分有抗黑曲霉活性。