[发明专利]快速提取及扩增加拿大一枝黄花基因组的方法

说明书

技术领域

本发明涉及提取及扩增加拿大一枝黄花基因组的方法，特别是一种快速提取及扩增加拿大一枝黄花基因组的方法。

背景技术

加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.）原产于北美，现在，它已扩散到欧洲、亚洲和澳大利亚等地，成为世界范围内的一种入侵性外来植物。加拿大一枝黄花于1935年作为花卉引入中国，经过70余年的入侵、定居、扩散过程，已扩散至14省、市、区。遗传多样性是影响外来物种成功入侵的重要因素之一。加拿大一枝黄花遗传多样性研究，一般都有大量样品需要提取基因组DNA，工作量大，耗时、费力，因此国内外都在探索快速、简便、经济、有效的提取方法（杨杰，2005；Virk P S et al.，1999）。

目前所存在的植物基因组提取方法主要有：CTAB法（董梅，2009）、SDS法、试剂盒法、NaOH法。

CTAB法：即十六烷基三甲基溴化铵法。这是最广泛地用来分离植物 DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂 CTAB 溶解植物细胞膜，并与 DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合多种类型的组织提取DNA。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本到许多克的新鲜材料均可使用。但该方法比较花费时间，且所需试剂较多。

SDS法：即十二烷基硫酸钠法。此方法的优点是比较快速简便，可大量提取，而且小于10 mg的新鲜叶子材料就可以产生足够的 DNA。这个方法存在的问题是 DNA沉淀物可能不够紧密，或不一定能形成一紧密的DNA沉淀。且耗费时间也较多，所需试剂也不少。

试剂盒法：即植物基因组DNA试剂盒提取法。提取的效果比较好，可做对照组。但成本比较高，不适合大批量提取。

NaOH法：DNA核蛋白能溶于水及高浓度的NaCl溶液，而难溶于0.14mol/L NaCl溶液，基于这一原理，利用强碱溶液和机械作用使细胞破裂，利用Tris—HCI的离子活性使DNA和蛋白质分离，通过离心除去杂质，可以获得DNA。过去曾用于水稻等植物大量样本的基因组DNA提取，未见用于提取加拿大一枝黄花基因组DNA的报道。发明人使用该现有的法提取加拿大一枝黄花基因组DNA时，遇到提取的基因组DNA样品在-20℃冰箱不能存放的问题。

综上所述，CTAB法和SDS法虽能够获得基因组DNA，但缺点是都不够快速、简便，提取一次基因组DNA均要超过两个小时；试剂盒法提取的基因组DNA质量高，但成本太大，可作对照，不适合大批量提取；NaOH法能够快速提取基因组，但经实践后发现，使用该法提取的加拿大一枝黄花基因组DNA不宜保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速提取及扩增加拿大一枝黄花基因组DNA的方法，采用该方法提取的加拿大一枝黄花基因组DNA适宜保存。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速提取加拿大一枝黄花基因组的方法，包括以下步骤：

1）、称取0.1～0.2 g加拿大一枝黄花的叶片放入容器中，加入液氮后，将叶片研磨成粉末；

备注说明：研磨完毕后，液氮已基本挥发完；

2）、在步骤1）的所得物中加入38~42 μL的浓度为0.23~0.27 mol/L的NaOH溶液作为提取剂，再加入150~170 μL的浓度为100 mmol/L的 Tris-HCl以及加入10～20 μL的β-巯基乙醇进行研磨（研磨充分）；然后离心，取上清液（约30～50 μL）并加ddH₂O至200 μL；得加拿大一枝黄花的DNA模板，该DNA模板置于-20 ℃冰箱中保存。

作为本发明的快速提取加拿大一枝黄花基因组的方法的改进：

步骤1）中，容器为1.5 mL的离心管，研磨为选取以下任意一种方法：

方法一、加入液氮1次，直至整个离心管被液氮充满；待离心管内的液氮挥发至≤50 μL时，用塑料研磨棒将离心管中的叶片研磨成粉末；

方法二、加入液氮2次，待离心管内第一次加入的液氮挥发完毕后立即加入第二次液氮，待离心管内第二次加入的液氮挥发至≤50 μL时，用塑料研磨棒将离心管中的叶片研磨成粉末；每次加入的液氮均为直至整个离心管被液氮充满。

作为本发明的快速提取加拿大一枝黄花基因组的方法的进一步改进：

步骤2）中的离心为：10000~14000 r/min离心4~6 min。

作为本发明的快速提取加拿大一枝黄花基因组的方法的进一步改进：

步骤2）为：