[发明专利]一种植物双元表达载体pMHZ111及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是一种植物双元表达载体pMHZ111及其在改变人参皂苷含量的应用。 

背景技术

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为我国古老而名贵的药用植物，系五加科（Araliaceaae）人参属植物，是一种具有潜力的药用植物，在人类保健和医疗上应用广泛。医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分之一， 

人参皂苷（Ginsenoside，GS）是人参主要的药理活性成分，至今人们已经从人参植物中分离出至少40多种人参皂苷单体，按人参皂苷在薄层色谱中Rf值的大小，由小到大命名为R₀、Ra、Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rg₃ 等。人参皂苷均属于三萜类皂苷，可分为三大类：第一类二醇型，如人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、Rh₂等；第二类三醇型，如人参皂苷Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rh₁等；第三类齐墩果酸型, 如人参皂苷R₀、Rh₃ 等。其中二醇型和三醇型皂苷占绝大多数，被认为是人参的最主要活性成分。人参皂苷除单体皂苷外还含有蛋白质、酶类、多肽、氨基酸、人参多糖、人参挥发油、人参二醇、人参三醇等。

人参皂苷属于三萜类皂苷。四环三萜类物质是以异戊二烯为基本结构单元，其合成符合异戊二烯合成途径。近年来研究表明，植物类异戊二烯的生物合成至少存在2 条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径。大量文献报道，甲羟戊酸途径是皂苷三萜苷元合成必要途径。目前对三萜皂苷的生物合成途径已有一些了解，研究证明三萜皂苷的合成首先通过甲羟戊酸途径合成2，3-氧化鲨烯，随后在氧化鲨烯环化酶（squalene oxide cyclase，OSC）的作用下形成各种三萜类。最后经细胞色素P450、糖基转移酶（GT）和β-糖苷酶的作用，形成各种类型的三萜皂苷（Dong et al.，2005）。 

三萜皂苷的生物合成途径至少存在两条，一条一般以甲羟戊酸为前体，即甲羟戊酸途径，它在细胞质中进行，并以糖酵解产物乙酰辅酶A作为初供体。甾体类和倍半萜化合物通过这一途径合成。主要分为三个阶段：①活性异戊二烯单位一异戊烯焦磷酸酯(isopentenyl一pyrophosphate，IPP)和γ，γ一二甲基丙烯基焦磷酸酯(dimethylally pyrophosphate，DMAPP)的生物合成；②鲨烯 (squalene)的生物合成及环化；③环上复杂的官能团的反应过程，最后形成完整的三萜皂苷分子。整个三萜皂苷的生物合成过程包括鲨烯合酶 (squalene synthase，SQS)、鲨烯环氧酶 (squalene epoxidase，SE)、法呢基焦磷酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase，FPS)、单加氧化酶(monooxygenase，MO)、氧化鲨烯环化酶 (oxidosqualene cyelase，OSC)、羊毛脂甾醇合酶 (lanosterol synthase，LSS)、β一香树素合酶(β一Amyrin Synthase，bAS) 、环阿屯醇合酶 (Cyeloartenol Synthase，CAS)、达玛烷型合酶 (dammarenediol synthase，DMS)和羽扇豆型合酶 (Iupeol synthase，LS)等一系列酶的催化。其环上官能团的合成主要有细胞色素P₄₅₀(Cytoehrome P₄₅₀)、糖基转移酶(glyeosyltransferase，β一glyeosylase)、β一糖苷酶(β一glyeoside hydrolase，β一glyeosidase)等多种酶的催化，使三萜的种类更多样化，并形成复杂的糖苷化合物。鲨烯是三萜、甾醇、胆固醇等物质生物合成重要的共同前体，是鲨烯合酶SQS催化合成的产物。SQS在鲨烯后续生物合成支路中处于关键地位。SQS所催化的反应在三萜生物合成途径中，位于碳源从类异戊二烯途径流向萜类、甾醇合成途径的分支上，是生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质过程中的一个关键酶，其含量和活性决定了后续产物的合成^[66]。目前己有酵母 (AF092497，AB012604)、小鼠(NM_010191)、大鼠(M95591)、人(L06105，X69141)及12科17属41条植物SQS的cDNA序列已在GenBank登录(至2008一03一01)，如Panax ginseng ABI22078、AB010148，Centella asiatica AY787628，Artemisia annua AF302464，Arabjdopsis thalisna D29017，Oryza sativa AB007501等。