[发明专利]重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，属于属于基因工程和生物技术领域。

背景技术

抗菌肽是在诱导条件下,生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α-螺旋型、β-折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸的等多种类型。抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有很强的杀灭作用，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品工业等方面。在医药卫生方面，抗菌肽与抗生素最大的不同之处在于抗菌肽的应用可以解决抗药性的问题。具有与抗生素完全不同杀菌机理的抗菌肽的应用或许可以为这些问题的解决提供途径。在食品工业上抗菌肽的应用主要是食品添加剂。抗菌肽的杀菌能力很强，并且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有广泛的杀菌作用，因此可以代替传统的食品防腐剂，起到保鲜作用。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害。此外，抗菌肽在、畜牧业、农业等各个方都有十分广泛的应用。研究其大规模生产具有十分积极的意义。

目前，生产抗菌肽的方法主要有三种：1.直接从生物体中提取天然抗菌肽：抗菌肽广泛存在于低等到高等动物的特定组织中，但是含量非常少，且提取工艺复杂，成本昂贵，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成抗菌肽：化学合成法成本高，同时难以保证合成肽类的天然结构和生物活性，严重影响其广泛应用；3基因工程方法：采用该方法是如今研究的热点，也是获得抗菌肽的有效途径之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，对于阳离子抗菌肽而言，融合蛋白所带的负电荷可以有效避免抗菌肽对宿主菌的毒性，有利于其产量的提高。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，其含有核苷酸序列为：

SEQ ID：NO 1：

CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG；

SEQ ID：NO2：

CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT；

编码的氨基酸序列为：

SEQ ID NO3：

QRSVSNAATRVCRTGRSRW；

SEQ ID NO4：

HHHHHHMAEQ SDKDVKYYTLEEIQKHKD SKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种构建上述工程菌的方法。

一种构建上述重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其步骤为：

（1）以含有G13基因序列的质粒为模板，在G13上游设置NcoI酶切位点进行PCR扩增，引物为：

G13F：5’-CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，

G13R:5’-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’；

（2）以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列下游设置EcoRI酶切位点进行PCR扩增，引物为：

CF：5’-CACCATCATCATCATCAT-3’，CR:：5’-GGAATTCTTAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3’；

（3）将G13基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物等量混合，磷酸化后进行连接，再引入（1）中的引物G13F和（2）中的引物CR进行PCR扩增；