[发明专利]重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，其含有核苷酸序列为：

SEQ ID：NO 1：

CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG；

SEQ ID：NO2：

CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT；

编码的氨基酸序列为：

SEQ ID NO3：

QRSVSNAATRVCRTGRSRW；

SEQ ID NO4：

HHHHHHMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。

2.一种构建如权利要求1所述的重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，步骤为：

（1）以含有G13基因序列的质粒为模板，在G13上游设置NcoI酶切位点进行PCR扩增，引物为：

G13F：5’-CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，

G13R:5’-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’；

（2）以含有融合蛋白基因的质粒为模板，在序列下游设置EcoRI酶切位点进行PCR扩增，引物为：

CF：5’-CACCATCATCATCATCAT-3’，CR:：5’

-GGAATTCTTAAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3’；

（3）将G13基因PCR产物和融合蛋白基因PCR产物等量混合，磷酸化后进行连接，再引入（1）中的引物G13F和（2）中的引物CR进行PCR扩增；

（4）将（3）的PCR产物通过DNA重组克隆至载体质粒pET-22b-G13C，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性重组子；

（5）将（4）的产物振荡培养至对数期，通过诱导剂诱导后收集菌体。

3.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件均为：94℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 10min，并且，反应产物均用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

4.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，混合物是由T4PNK进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接。

5.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，PCR产物用EcoRI和NcoI酶切，经纯化后用T4DNA连接酶连接得到载体质粒pET-22b-G13C。

6.根据权利要求2所述的构建重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤（5），将步骤（4）产物接种至含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB培养基，37℃振荡培养至OD600≈0.5时，加入终浓度1mmol/L的IPTG，30℃诱导6h，9000r/min离心1min，收集菌体。