[发明专利]一种肠上皮间淋巴细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞分离技术，涉及一种肠道中的肠上皮细胞间淋巴细胞的分离方法。

背景技术

肠道是机体最大、最复杂的粘膜免疫器官，是识别“自我”和“异我”的重要器官，也是病原体入侵机体的主要门户，因此肠道粘膜免疫系统构成了机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障。

肠道粘膜免疫系统包括集合粘膜相关淋巴组织(肠系膜淋巴结、Peyer’s结)和弥散粘膜相关淋巴组织(包括固有层淋巴细胞和肠上皮间淋巴细胞)。肠上皮间淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，iIELs)是分散在肠道上皮细胞基底面之间的一种T淋巴细胞，即细胞表面标记为CD3⁺，并且85％以上为CD8⁺T淋巴细胞，而且含有15％以上的T细胞受体CD8⁺TCRγδ⁺，是肠道粘膜免疫反应中的效应细胞，可分泌细胞因子，具有淋巴毒T淋巴细胞的作用，同时可抑制粘膜部位的过敏反应。

因此，iIELs在不同生理病理状态下发挥着不同的免疫调节功能，在肠道粘膜免疫反应中具有非常重要的作用。目前分离iIELs多数采用机械法或酶消化法，不仅花费大量的时间，分离细胞非常复杂，存活率低，而且降低了分离后的iIELs的细胞活性，不利于针对性的研究iIELs的免疫调节功能。如何有效地分离肠道中的iIELs是急需解决的一个技术问题，为进一步深入研究iIELs在肠道粘膜免疫中的调节作用提供一个有力的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种存活率高的分离肠上皮间淋巴细胞的方法，能有效地分离肠道中的上皮间淋巴细胞iIELs。

本发明所述的目的是通过以下措施实现的：

一种淋巴细胞分离方法，其特征在于所述分离方法是利用温差法与淋巴细胞分离液相结合的方法。

上述淋巴细胞是肠上皮间淋巴细胞。

上述温差法是指待分离细胞在0-5℃冰浴后，在0-5min内转移到30-40℃培养基中。优选为4℃冰浴，瞬间转移到37℃培养基中。瞬间转移是指在0-10s内转移。

上述冰浴的时间为1-4小时。优选为2小时。

上述培养基是含有1mM二硫代苏糖醇和10％小牛血清的DMEM培养基。

上述淋巴细胞来源于大鼠小肠组织。

上述淋巴细胞分离方法，其特征在于由以下步骤组成：

(1)小肠组织的提取和处理：将禁食过夜的健康大鼠处死后，提取小肠组织，并用PBS冲洗肠腔，剪去peyer’s结后，置于含有10％小牛血清、1％青链霉素双抗的PBS中冰浴。

(2)iIELs的分离：利用30-40C预热的含有1mM二硫代苏糖醇和10％小牛血清的DMEM培养基反复冲洗小肠组织肠腔，顺着肠道轻轻挤出肠腔中内容物。静置后离心，利用大鼠淋巴细胞分离液分离iIELs。

(3)所获得的iIELs的鉴定：通过胎盘蓝染色检测iIELs的活性，利用抗大鼠的APC-CD3、FITC-CD8和PE-TCRγδ荧光抗体进行染色，通过流式细胞仪进行鉴定。

上述淋巴细胞分离方法，其特征在于由以下步骤组成：

第一步，实验动物的选择

选择无特殊病原体感染(SPF级)的健康大鼠(6～8周，雌雄不限)，禁食过夜；

第二步，小肠组织的提取及处理

利用CO₂处死大鼠后，迅速剖腹，从胃的幽门下段1cm处剪断小肠，直至盲肠上段1cm处取出小肠全部组织于PBS中；

利用PBS反复清洗肠道，以去除肠道内的内容物及粘液；从小肠浆膜面剪去整个肠段中的每个peyer's结，并将已剪掉peyer's结的小肠段置于含有10％小牛血清和1％青链霉素双抗的PBS中，冰浴；

第三步，肠上皮间淋巴细胞(iIELs)的分离

利用37℃预热的含有1mM二硫代苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)和10％小牛血清的DMEM(Deulbecco's Modified Eagle Medium)培养基反复冲洗小肠肠腔后，用弯镊子顺着肠道轻轻将肠腔中的粘液及部分细胞挤出；

收集上述DMEM液体于离心管中，静置15分钟后，轻轻吸取上清于另一离心管中，离心；

加入小牛血清重悬细胞，使细胞悬液滤过100目的筛网后，将含有细胞的小牛血清缓慢加入到装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中，使淋巴细胞分离液与小牛血清细胞悬液中间保持明显的分层，离心；