[发明专利]检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性（SNP）的检测，特别涉及一种检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）就是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式，其中最少出现的1种等位基因频率不小于1%。碱基突变分为转换（嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶）和颠换（嘌呤-嘧啶） 2种。在原则上，突变处的碱基可以为A、T、C、G，但事实上SNP多发生在C和T 2个碱基之间。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的。SNP在非转录序列要多于转录序列，而且在转录区非同义突变（有氨基酸序列的改变）的频率，比其他方式突变的频率低得多。Halushka等（1999）通过对75个基因检测，推测人类基因组有百万个SNP 位点，其中大约有50 万个在非编码区，SNP的频率在基因的5′端非编码区、3′端非编码区、内含子、沉默位点及编码区有显著差异（p = 6. 6×10^-10），突变热点CpG 的频率在这5种区域中也存在显著差异（P = 0.025）。

在群体遗传研究中，SNP作为新一代的遗传标记，有以下特点: （1） 数量多且分布广泛: 据估计，基因组中大约平均每1000 bp就会出现1个SNP，这样它们在整个基因组的分布就会达到300万个，遗传距离为2～3 cM，密度比微卫星标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；（2）富有代表性：某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；（3） 遗传稳定性: SNP是基因组中分布最广泛且稳定的点突变，突变率低，与微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性， 尤其是处于编码区SNP；（4） 检测快速，易于实现自动化: SNP通常是1种双等位基因的遗传变异，在检测时无需像检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量，只需一个“+ /- ”或“全或无” 分析的方式，有利于自动化筛选或检测SNP；（5） 碱基的转换大于颠换：因为基因组中大多数C是甲基化的，能够自发的脱氨基产生T。因此SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化中有重要意义。

目前已经确定有7种IGFBPs(IGFBP1-7)，IGFBP-3是其中重要的一种，它是血液中最丰富的IGFBPs结合形式,血液中95%的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ都与IGFBP-3 结合，IGFBP-3有延长IGF半衰期、调节IGF的生物学活性等作用，故IGFBP-3对IGFs功能的发挥有很大影响，从而间接地影响畜禽的生长发育、繁殖性能及肉的品质等。目前，畜禽IGFBP-3基因多态性研究主要集中在牛和羊上。鸡IGFBP-3基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与家禽经济性状（如：体重、开产日龄、开产蛋重、开产体重、产蛋数等性状）关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明的目的是：针对上述不足，提供一种检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的多态性的检测方法。同时设计其与生产性状进行关联分析，验证其是否可以作为鸡分子育种辅助选择中的分子标记。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是： 

检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，包括如下步骤：

一、设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物

以NCBI 所公布的鸡NC_006089序列为参考，设计能够扩增包含鸡IGFBP-3基因第二外显子区域的引物P，其序列如下：

上游引物为：CATCTTGGGACCAGTGCTTT  20；

下游引物为：ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG  20；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段

a、鸡样本的采集

采集多个地方的鸡种作为检测对象，以包含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA为模板；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增鸡IGFBP-3基因片段