[发明专利]检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法

权利要求书

1.检测鸡IGFBP-3基因第二号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括如下步骤：

一、设计鸡IGFBP-3基因第二外显子区域PCR引物

以NCBI 所公布的鸡NC_006089序列为参考，设计能够扩增包含鸡IGFBP-3基因第二外显子区域的引物P，其序列如下：

上游引物为：CATCTTGGGACCAGTGCTTT  20；

下游引物为：ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG  20；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的IGFBP-3基因片段

a、鸡样本的采集

采集多个地方的鸡种作为检测对象，以包含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA为模板；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡IGFBP-3基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增鸡IGFBP-3基因片段

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组DNA模板，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为19—25μL，其包括10×PCR Buffer 2.0—3.0μL、浓度为25mmol/L的Mg²⁺  2.2—2.5μL，浓度为2 mmol/L的dNTPs 0.8—1.5μL，浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL，浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2—0.6μL，浓度为100 ng/μL的DNA模板1 .0—1.5μL，超纯水11.8—12.5μL，扩增程序为：控制温度为92—96 ℃，对PCR反应体系进行预变性处理4—6 min，保持温度在92—96 ℃，变性处理50—70 s，然后降低温度至54—58 ℃，进行退火处理20—40 s，退火处理完毕后，升高温度至70—74 ℃，再进行延伸处理20—40s，将上述的变性处理——退火处理——延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30—35个循环，操作完成后控制温度为70—74 ℃，延伸处理9—10 min，再降低温度至9—10 ℃，对PCR反应体系进行保存；

三、MspI酶切反应消化PCR扩增的IGFBP-3基因片段

 MspI酶切反应消化体系包括4.6—5.2μL PCR产物，限制性内切酶MspI5U，10×Buffer 0.8—1.1 μL，双蒸水5—6 μL，酶切消化条件为：65℃恒温水浴消化6—8h；

四、MspI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

a、制作浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，点样后采用180V电压电泳25—35min，电泳结束后EB染色；

b、待分子量不同的待测鸡全基因组DNA分离清晰时，在柯达凝胶成像系统成像；

c、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性；

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定鸡IGFBP-3基因第1087位的单核苷酸多态性为：CC型表现为95bp和66bp两条条带，CT基因型表现为161bp、95 bp和66 bp三条条带，TT基因型表现为161bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析；

五、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点的频率统计分析；

六、进行鸡IGFBP-3基因SNP位点基因效应的关联分析

第1087位点的TT基因型可以作为一个提高鸡产蛋数的候选分子遗传标记。