[发明专利]一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞（Autologous immunotherapy lymphocytes，AIL）的培养方法，属于免疫细胞体外培养技术领域。

背景技术

过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞（具有特异免疫力）或其产物输给细胞免疫功能低下者（如肿瘤病人），使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。基于肿瘤的发生、发展和预后与机体免疫功能，尤其是细胞免疫功能关系密切，1985年美国国家癌症研究委员会将癌症的免疫疗法确立为继外科手术、放射疗法和化学药物疗法之后的第四种疗法。AIL细胞即属于过继免疫疗法中的一员。与传统方法相比，AIL细胞因具有以下四个方面的优势而广泛应用于临床：

1、减少恶性肿瘤术后复发与转移。手术后进行免疫治疗，可显著增强肿瘤患者免疫系统功能，有利于清除术后体内残留的癌细胞及微转移灶，降低局部复发和向远处转移的概率。

2、参与肿瘤综合治疗。肿瘤是一个由遗传因素及环境因素综合作用引起的多基因突变疾病。因此它的治疗方案也是几种治疗方式的综合。在肿瘤放疗和化疗间歇期间进行免疫细胞治疗，有助于增强患者自身的免疫力，从而增加对放疗和化疗毒副反应的耐受能力，提高癌症综合治疗的疗效。

3、少数肿瘤的主要治疗手段。免疫细胞治疗是肝癌、肾癌、恶性黑色素瘤等一些对放化疗敏感性较低的恶性肿瘤的有效治疗手段。

4、改善晚期癌症患者的生活质量。由于免疫细胞治疗的副作用极低，可以减轻晚期患者的痛苦，提高他们的生活质量。

AIL技术较之其他过继免疫治疗方法，如LAK、TIL等技术，在安全性和有效性上作了近一步的提高和优化，具有如下特点：

I、AIL细胞是以杀伤性T淋巴细胞为主的混合性T淋巴细胞和NK细胞群体；其中CD3⁺CD56⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞是主要的效应细胞。

II、采用无血清培养体系：AIL细胞体外培养体系采用独特的无血清培养基和细胞因子组合。无血清培养系统避免了因使用血清可能导致的细胞污染及其它对细胞生长的不利因素；所采用的细胞因子均为药用级别。

III、细胞扩增效率高，不需要使用单核细胞采集机：在体外高效活化和扩增患者自身的T淋巴细胞，从1-2×10⁷外周血单个核细胞开始，可以获得1-2×10¹⁰活化扩增的以杀伤性T淋巴细胞为主的T细胞和NK细胞混合细胞群体，这种高效扩增，避免了需要使用大量起始外周血单个核细胞对患者整体免疫细胞系统的破坏作用。

IV、细胞活性高、稳定性好：AIL细胞培养体系培养出的细胞，活性和稳定性好，细胞可保存12个小时而不影响其治疗效果（细胞活性>95%）。特别是AIL可以冻存细胞，精准的培养系统紧密配合手术、放疗和化疗。

现有的自体淋巴细胞培养技术扩增效率较低，细胞杀瘤活性弱，批间稳定性较差，往往需要采集较多的外周血，甚至需要用单采机直接采集患者单个核细胞，对患者身体影响较大，有的患者在采集后会出现浑噩的现象。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种培养自体外周血淋巴细胞的方法。

术语说明

PBMC：外周血单个核细胞；

IL-2：白细胞介素2；

PHA-p：植物凝集素P；

IL-1α：白细胞介素1α；

IFN-γ：干扰素γ；

CD3mAb：细胞表面分子3单克隆抗体；

CD28mAb：细胞表面分子28单克隆抗体。

本发明的技术方案如下：

一种培养自体外周血淋巴细胞的方法，包括如下步骤：

（1）从外周血中分离PBMC，然后，重悬于无血清培养基中，使PBMC的细胞浓度为（1～2）×10⁶个/mL，静置培养72～84小时，制得初培养液；

（2）向步骤（1）制得的初培养液中补加无血清培养基至初培养液的2～3倍，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，静置培养84～96小时，得二次培养液；

（3）向步骤（2）制得的二次培养液中补加无血清培养基至二次培养液的4～5倍，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为（1～2）×10³U/mL，静置培养72～84小时，得培养液；