[发明专利]一种核酸扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种核酸扩增方法。

背景技术

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突破。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段。

尽管PCR技术长期占据着核酸扩增技术的垄断地位，但后续研发的一系列等温（isothermal）核酸扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下（如37℃），实现核酸（DNA或RNA）的扩增。国际国内已有的恒温扩增技术如：核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence based amplification,NASBA)、转录介导扩增技术（transcription-mediated amplification,TMA）、链置换扩增技术（Strand Displacement Amplification,SDA）、滚环扩增技术（Rolling Circle Amplification,RCA）、解链酶扩增技术（Helicase Dependant Amplification,HAD）、单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification,SPIA）和切刻内切酶核酸恒温扩增（Nicking endonuclease mediated amplification,NEMA）等等。其中，核酸序列扩增技术（NASBA）和转录介导扩增技术（TMA）是目前国际上最成熟的恒温扩增技术，在研究及临床检验领域被广泛应用。本发明方法与这两种技术紧密相关。

NASBA和TMA两种核酸扩增方法都需要四种酶活性来完成：依赖RNA的DNA聚合酶活性、依赖DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶H活性和RNA聚合酶活性。这些活性中的一些可以联合在一种酶中，所以通常只有2或3种酶是必需的。两种方法的区别在于所选择的逆转录酶不同，NASBA方法使用禽成肌细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，而TMA方法选用莫洛尼属白血病病毒(M-MLV)逆转录酶。它们的扩增原理相似:目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成带双链T7启动子序列的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。最后可通过一些方法（比如添加分子信标探针）检测扩增产物来定量或定性靶核酸。实际上，从样品中的单链RNA开始，一旦将所有的成分放在一起，并将混合物置于适当的温度以让酶都有活性，整个一系列事件就会发生，无需人为干预。

勿庸置疑，TMA或NASBA技术扩增方法对于单链RNA的扩增特别有效。然而当对只以双链DNA的形式存在（环状或线性）的靶核酸实施TMA或NASBA的扩增方法时，必须将DNA转变成单链核酸，合成出RNA。

在EP397269中描述了一种方法，双链DNA用限制性内切酶进行预处理，之后用加热分离步骤使其形成单链DNA。在该方法中使用第一引物P1（启动子引物），其3`部分含有与DNA双链中的一条3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T<sub>7</sub>）识别的启动子序列。其中第一引物的5`启动子序列可以作为用于从DNA链3`末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。随后的反应进程与普通的TMA或NASBA方法完全一致。其反应过程如图1。当DNA是单链时，限制性寡核苷酸（RP）或限制性引物含有与包括目标DNA的限制位点的区域互补的序列，将其和限制性内切酶一起添加，如图2。限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸内。bioMerieux公司采用该方法解决HBV的等温扩增（NASBA）问题，95%的检出率为242 WHO IU/mL，50%的检出率为35 WHO IU/mL。

内切酶酶切变性使待测DNA变成单链进而形成所需RNA的设计打破了NASBA或TMA不能扩增DNA的禁锢，无疑具有非凡的意义。但是也存在明显的缺点：

1、该方法的使用前提是必需首先明确待测样本为单链还是双链DNA，从而采取不同的策略（是否添加RP）来进行。