[发明专利]一种核酸扩增方法

权利要求书

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，该方法从存在于样品中的DNA开始，其具体包括以下步骤：

A、在扩增缓冲液中温育待测样品，该温育体系中含有：

一或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶，该限制性切刻酶在该DNA的一条链上形成特定的3`末端；

启动子引物，该启动子引物的5`区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3`区域与该DNA链特定的3`末端反向互补；

第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5`末端；

B、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性切刻酶的消化；

C、将样品以足以失活限制性切刻酶和/或导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；

D、向样品中加入下列试剂，

具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶

具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶

具有RNaseH活性的酶

具有RNA聚合酶活性的酶

F、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为双链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列且其3`区域与该DNA酶切链特定的3`末端反向互补。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为单链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有与包括目标单链DNA的限制位点的区域互补的序列和可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为单链和双链的混合物且该两种或多种DNA具有一种或多种相同或不同的限制性切刻酶酶切位点，实现不同核酸模板的同时检测。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品为含有乙型肝炎病毒DNA的样品或梅毒螺旋体病毒DNA的样品。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述温育的温度为35~45℃。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述加热的温度为92~98℃。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述限制性切刻酶为Nb.BtsI或Nt.CviPII。

9.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括启动子引物、反向引物、分子信标探针和限制性切刻酶。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物具有SEQ ID No:1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nt.CviPII。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物具有SEQ ID No:4所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:5所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:6所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nb.BtsI。

12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物3`端带有氨基修饰。

13.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述反向引物的5`端第13位为锁核酸碱基。